六種重要瓜類種傳細菌可視基因芯片篩查及瓜類果斑病菌交叉引物擴增檢測技術(shù)研究.pdf

1、瓜類作物在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位。種傳細菌是瓜類作物及健康種子生產(chǎn)中關(guān)注的重要對象，如西瓜嗜酸菌引起的瓜類果斑病，就是嚴重危害葫蘆科作物的國際性檢疫類病害，可在西瓜種植區(qū)造成大規(guī)模的經(jīng)濟損失。目前除瓜類果斑病菌外，其他瓜類種傳細菌病害還沒有快速可行的檢測方法，亦無檢測標(biāo)準，嚴重影響了口岸檢疫和疫情診斷的速度與效率。因此針對瓜類種傳細菌病害建立快速靈敏且能同時檢測多種目標(biāo)病菌的檢測技術(shù)顯得尤為迫切。本論文分別以可視基因芯片和交叉

2、引物擴增（cross-priming amplification，CPA）兩項技術(shù)為平臺，對重要瓜類種傳細菌病害的病原物進行新型檢測方法的研究。依靠這兩種新型分子生物學(xué)實驗技術(shù)建立的篩查、檢測方法，可以為瓜類種傳細菌的快速初篩及健康種子質(zhì)量控制提供新手段。
　　 本文針對細菌性白枯病菌（Pseudomonas viridiflava，Pv）、細菌性角斑病菌(P.syringae pv.lachrymans，Psl)、丁香假單胞丁

3、香致病變種(P.syringae pv.syringae，Pss)、瓜類果斑病菌（Acidovorax citrulli，Ac）、細菌性葉斑病菌(Xanthomonascucurbitae，Xc)、甜瓜黃單胞菌(X.melonis，Xm)六種瓜類種傳細菌，利用多重PCR擴增及可視芯片檢測技術(shù)，建立了可視基因芯片篩查方法。本研究應(yīng)用三對基于細菌DNA gyrase subunit B genes（gyrB）基因設(shè)計的屬內(nèi)通用引物，建立了擴

4、增效率良好的多重PCR檢測體系。芯片檢測實驗表明，以細菌純培養(yǎng)液為模板，六種目標(biāo)菌檢測靈敏度分別為，Pv:4.0×104CFU/mL; Psl:1.0×103 CFU/mL; Pss:2.0×103CFU/mL; Ac:4.5×103CFU/mL;Xm:3.0×104CFU/mL; Xc:2.0×104 CFU/mL。該結(jié)果比傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測普遍提高10倍。實驗還對新方法在種子樣品實體檢測中的應(yīng)用進行了初步研究，結(jié)果顯示可以從人工模擬

5、帶菌的西瓜、甜瓜、黃瓜的種子樣品及自然感染瓜類果斑病菌的西瓜種子上檢測到目標(biāo)細菌。在對29株來自不同種屬的非目標(biāo)細菌進行的特異性測試中，雖有8株細菌發(fā)生假陽性顯色，但因其不是瓜類作物的致病菌，由此判斷，在對瓜種進行檢測的過程當(dāng)中因以上非特異菌株導(dǎo)致結(jié)果呈陽性的可能性很小。與傳統(tǒng)的凝膠電泳法檢測PCR擴增產(chǎn)物相比，本研究建立的可視基因芯片檢測法可以排除因擴增片段大小相似而導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，具有高效、實用、高通量以及無需信號分析處理裝置等優(yōu)

6、點，可以作為瓜類種傳細菌病害的初篩手段進行應(yīng)用。
　　 研究內(nèi)容的第二部分介紹了瓜類果斑病菌交叉引物擴增檢測方法的建立與初步應(yīng)用。通過結(jié)合應(yīng)用交叉引物擴增技術(shù)和膠體金檢測試紙條，建立了一種具有快速方便、靈敏特異、不需昂貴儀器等優(yōu)點的瓜類果斑病新型檢測方法，能夠高效地對葫蘆科作物的帶菌情況進行檢測。DNA序列經(jīng)過在恒溫條件下特異性擴增后，便能夠在一次性全封閉式靶核酸擴增物檢測裝置上直接觀察到實驗結(jié)果，整套操作過程只需提供離心機和簡

7、單的恒溫設(shè)備。本研究在A.citrulli的16S rDNA序列區(qū)段設(shè)計了三條引物及兩條探針。在針對菌懸液進行的靈敏度定量分析中，檢測水平為3.7×103 CFU/mL。在帶菌種子的實體檢測中，分別以人工模擬帶菌和天然帶菌的西瓜種子浸泡液中提取得到的DNA為模板，成功檢測出瓜類果斑病菌，并且證實了種子樣品檢測的靈敏度為1.8×103 CFU。本研究所建立的瓜類果斑病新型檢測方法，將會有效彌補傳統(tǒng)PCR、熒光定量PCR等技術(shù)在儀器不完善、