瓜類細(xì)菌性果斑病菌分子檢測技術(shù)的研究及應(yīng)用.pdf

1、本研究根據(jù)瓜類病原細(xì)菌可溶性蛋白的特異性，建立鑒定瓜類細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，簡稱A.a.c)的SDS-PAGE方法，根據(jù)SDS-PAGE圖譜直接鑒定出瓜類細(xì)菌性果斑病原菌，為植物檢疫部門檢測該類病菌提供一種快速、準(zhǔn)確的方法。 利用細(xì)菌16SrDNA基因的通用引物對供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定。將獲得的序列與GenBank中相關(guān)菌株的16SrDNA序列

2、進(jìn)行同源性分析。利用最大簡約法構(gòu)建了16SrDNA系統(tǒng)演化樹，并設(shè)計(jì)出檢測A.a.c的特異性引物。利用設(shè)計(jì)的特異性引物(BFB64/65)對各供試菌株進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果只有A.a.c菌株產(chǎn)生擴(kuò)增泳帶，產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。因此，構(gòu)建了快速檢測A.a.c病菌的PCR方法。 根據(jù)瓜類細(xì)菌性果斑病菌與相關(guān)細(xì)菌16SrDNA序列差異，設(shè)計(jì)出對A.a.c具有穩(wěn)定點(diǎn)突變特異性探針Aac-probe，利用該探針對供試菌株進(jìn)行了實(shí)時熒光PCR檢

3、測試驗(yàn)。結(jié)果表明，除瓜類細(xì)菌性果斑病菌能檢測到熒光增強(qiáng)信號外，其余菌株無熒光增強(qiáng)信號。實(shí)時熒光PCR的相對靈敏度明顯高于常規(guī)PCR，表現(xiàn)出特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，可有效地應(yīng)用于A.a.c菌的檢測。 本研究首次構(gòu)建瓜類細(xì)菌性果斑病菌可溶性蛋白的SDS-PAGE檢測方法；首次對A.a.c菌株16SrDNA序列進(jìn)行同源性分析，建立其在細(xì)菌系統(tǒng)演化樹上的分類地位；首次對實(shí)時熒光PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了對A.a.c的TaqMan實(shí)