腸炎沙門菌LPS合成相關(guān)基因rfaQ缺失株的構(gòu)建及其毒力研究.pdf

1、腸炎沙門菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis，Salmonella Enteritidis，SE）是一類具有廣泛宿主適應(yīng)性的兼性胞內(nèi)寄生菌。沙門菌在自然感染的情況下，能夠在諸如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等宿主細(xì)胞中進(jìn)行生長繁殖。大量研究證明，在巨噬細(xì)胞中的定植是沙門菌引起全身感染的一個重要進(jìn)程，沙門菌的效應(yīng)因子能夠介導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，使細(xì)菌在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳播。因此，沙門菌能夠通過受感染的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)

2、移到腸系膜淋巴結(jié)，繼而進(jìn)入淋巴循環(huán)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，沙門菌的毒力與LPS（lipopolysaccharide）有著密切的關(guān)系，LPS是一種高度乙?；奶侵?，能發(fā)揮屏障功能，阻止疏水溶質(zhì)（如抗生素和洗滌劑）通過被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。在大腸桿菌和沙門菌等革蘭陰性菌模型的研究中，LPS被認(rèn)為是合成外膜的重要組成部分，也是細(xì)菌發(fā)揮毒力的重要因子。本研究通過同源重組法成功地構(gòu)建了腸炎沙門菌rfaQ基因缺失株和回復(fù)株，并通過細(xì)胞侵襲、增殖等實驗，研究該

3、基因?qū)ι抽T菌毒力的影響，為進(jìn)一步探索腸炎沙門菌rfaQ基因的功能奠定基礎(chǔ)。
　　1、腸炎沙門菌RfaQ蛋白的原核表達(dá)及rfaQ缺失株的構(gòu)建與鑒定
　　本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)成功地構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-rfaQ，并成功將其導(dǎo)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，通過IPTG的誘導(dǎo)，成功地表達(dá)出了腸炎沙門菌C50041LPS的RfaQ蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白His-RfaQ以包涵體的形式表達(dá)。并

4、用該His-RfaQ蛋白制備了鼠多克隆抗體。
　　利用λ-Red同源重組系統(tǒng)對腸炎沙門菌rfaQ基因進(jìn)行了敲除，成功地構(gòu)建了腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株C50041 rfaQ基因缺失株;通過重組子成功地構(gòu)建了回復(fù)株C50041△rfaQ∷rfaQ，該回復(fù)株能夠體外重組表達(dá)rfaQ基因。Realtime-PCR試驗結(jié)果表明，缺失株的rfaQ基因成功被敲除，而回復(fù)株的rfaQ基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平則為野生株的20倍以上。對野生株、缺失株及回復(fù)株的

5、菌體裂解蛋白進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示抗RfaQ多克隆抗體只能從回復(fù)株裂解蛋白中檢測到大小為44kDa的目的蛋白，表明缺失株已經(jīng)成功地敲除了rfaQ基因，且回復(fù)株能夠表達(dá)具有免疫學(xué)活性的RfaQ蛋白。對rfaQ突變株的生化特性、生長特性、運(yùn)動性以及LPS結(jié)構(gòu)鑒定等結(jié)果顯示:與野生株C50041的相比，rfaQ缺失株的生長特性和LPS的整體結(jié)構(gòu)并沒有顯著差異，但缺失株的運(yùn)動能力明顯減弱，且其生化指標(biāo)O129R由陽性

6、變成了陰性。腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株C50041 rfaQ基因缺失株的成功構(gòu)建為后期對rfaQ基因功能的研究提供了相應(yīng)的生物材料。
　　2、腸炎沙門菌野生株與咖Q缺失株毒力測定
　　本研究對野生株和rfaQ缺失株的毒力進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示:缺失株C50041△rfaQ的LD50（約為1×109 CFU）較野生株C50041 LD50（約為1×106 CFU）升高了1000倍左右。對鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7和禽源巨噬細(xì)胞HD-11

7、的細(xì)胞黏附攝取實驗結(jié)果顯示:與野生株C50041相比，缺失株對細(xì)胞RAW264.7的黏附率有顯著下降(P＜0.05)，但攝取率沒有明顯差異。缺失株對細(xì)胞HD-11的黏附率沒有顯著性差異，但攝取率卻有顯著下降(P＜0.05)。細(xì)胞內(nèi)的增殖實驗結(jié)果顯示:在禽源巨噬細(xì)胞HD-11中，野生株與缺失株在四個時間點（1h、5h、10h和24 h）的增殖情況沒有明顯的差異(P＞0.05)。而在鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7中，缺失株在5h和10h這兩個

8、時間點增殖倍數(shù)明顯高于野生株(P＜0.05)。此外，競爭實驗結(jié)果顯示:野生株和缺失株的體外競爭指數(shù)為0.117（±0.0002）;在鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7中0h、5h、10h的競爭指數(shù)分別為0.796(±0.0027)、0.561（±0.013）、0.091（±0.0003）;在禽源巨噬細(xì)胞HD-11中0h、5h、10h的競爭指數(shù)分別為0.474（±0.055）、0.780（±0.012）、0.531（±0.0056）;在雞體脾臟