腸炎沙門菌sipA缺失株的構(gòu)建及SipA蛋白促炎效應(yīng)初步研究.pdf

1、腸炎沙門菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis, SE)是革蘭陰性、兼性胞內(nèi)寄生菌，主要寄生在人和動(dòng)物的腸道，可引起胃腸炎甚至嚴(yán)重的全身性感染，是重要的人獸共患病病原菌。由SPI-1和SPI-2編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是沙門菌致病重要的毒力因子之一，T3SS的效應(yīng)蛋白在細(xì)菌致病過(guò)程中發(fā)揮多重功能。目前針對(duì)這些效應(yīng)蛋白的研究主要以鼠傷寒沙門菌為模型，在腸炎沙門菌中的功能研究鮮有報(bào)道。鼠傷寒

2、沙門菌SipA是由與侵襲相關(guān)的T3SS-1分泌至宿主細(xì)胞的效應(yīng)蛋白。SipA蛋白通過(guò)羧基端調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)促進(jìn)沙門菌侵襲腸上皮細(xì)胞，通過(guò)氨基端激活腸上皮細(xì)胞的信號(hào)通路，引起腸道的炎癥。本研究采用λ-Red同源重組技術(shù)構(gòu)建腸炎沙門菌sipA基因缺失株，探討了sipA與腸炎沙門菌致病性的關(guān)系，為進(jìn)一步研究腸炎沙門氏菌感染過(guò)程中sipA基因的功能奠定基礎(chǔ)。
　　1、腸炎沙門菌SipA蛋白的原核表達(dá)及腸炎沙門菌C50336Δsip

3、A缺失株的構(gòu)建與鑒定
　　本研究利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-sipA，并將其導(dǎo)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，通過(guò)IPTG的誘導(dǎo)，表達(dá)了腸炎沙門菌C50336的效應(yīng)蛋白SipA。SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白SipA以可溶性的形式表達(dá)，并且蛋白大小與預(yù)期一致。將純化的SipA蛋白免疫BALB/c小鼠后制備其多抗血清。
　　利用λ-Red同源重組系統(tǒng)對(duì)腸炎沙門菌sipA基因進(jìn)行了敲除，

4、成功構(gòu)建腸炎沙門菌C50336的sipA基因缺失株。將sipA基因克隆至回復(fù)質(zhì)粒pBR322后電轉(zhuǎn)化缺失株中，構(gòu)建回復(fù)株C50336ΔsipApsipA。用制備的多抗血清作一抗，Western blot檢測(cè)SipA蛋白體外表達(dá)情況，結(jié)果顯示SipA蛋白能在體外培養(yǎng)條件下表達(dá)。比較野生株C50336、缺失株C50336ΔsipA及回復(fù)株C50336ΔsipApsipA的基本生物學(xué)特性及毒力。結(jié)果顯示:sipA基因的缺失不影響C50336的

5、生長(zhǎng)特性、生化特性以及毒力，且缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。腸炎沙門菌sipA基因缺失株的成功構(gòu)建為后期研究sipA基因在腸炎沙門菌致病過(guò)程中發(fā)揮的作用提供了相應(yīng)的生物材料。
　　2、腸炎沙門菌SipA蛋白促炎效應(yīng)的初步研究
　　對(duì)腸炎沙門菌野生株C50336、缺失株C50336ΔsipA及回復(fù)株C50336ΔsipApsipA進(jìn)行Caco-2細(xì)胞黏附和侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明sipA基因缺失不影響腸炎沙門菌的黏附能力，但引起細(xì)菌侵

6、襲能力降低。分別將野生株、缺失株及回復(fù)株侵襲Caco-2 BBE細(xì)胞0.5 h，Western blot及激光共聚焦顯微鏡鑒定細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)情況，并測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，sipA基因缺失株引起細(xì)胞的促凋亡蛋白Bax表達(dá)下調(diào)，且細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例顯著降低。
　　構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-sipA并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光鑒定，SipA在HEK293T細(xì)胞得到表達(dá)。將真核表達(dá)質(zhì)粒

7、pcDNA3.1 flag-sipA分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T、HeLa細(xì)胞后利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性。將野生株、缺失株及回復(fù)株感染已轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告載體(pGL4.32)的HeLa細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果顯示，真核表達(dá)pcDNA3.1 flag-sipA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T、HeLa細(xì)胞后，與空載體轉(zhuǎn)染結(jié)果相比，兩種細(xì)胞的NF-κB活性顯著上調(diào)。與野生株和回復(fù)株

8、相比，sipA基因缺失株引起HeLa的NF-κB活化程度顯著降低。從蛋白和細(xì)菌兩個(gè)水平說(shuō)明SipA能夠活化NF-κB信號(hào)通路。
　　將野生株、缺失株、回復(fù)株口服感染鏈霉素處理的C57BL/6小鼠進(jìn)行組織切片的觀察以及血清中細(xì)胞因子的測(cè)定。組織切片結(jié)果顯示，缺失株感染組肝臟、結(jié)腸、盲腸的病理變化程度輕于野生株和回復(fù)株感染組。與野生株和回復(fù)株相比，缺失株感染組血清中IL-6、MCP-1、TNF-α和IFN-γ顯著降低，說(shuō)明SipA蛋白