RNAi沉默PTHrP基因的表達對SPC-A-1BM細胞侵襲力影響的研究.pdf

1、目的：探討甲狀旁腺激素相關蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP)基因的沉默對SPC-A-1BM細胞侵襲能力及其對細胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)基因表達的影響。
　　方法：本實驗共設置5個組，其中1-3組為實驗組（小siRNA干擾組，針對目的PTHrP基因設計3條不同序列的s

2、iRNA-PTHrP），4組：陰性對照組（非特異性陰性對照siRNA），5組：空白對照組（無siRNA干擾）。通過核酸轉染試劑脂質體LipofectamineTM2000（Lipo2000）介導小干擾siRNA轉染高轉移性人肺腺癌細胞株（SPC-A-1BM）細胞；Transwell細胞遷移實驗用于檢測轉染后SPC-A-1BM細胞的侵襲能力；實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time quantitative polymerase ch

3、ain reaction，Real-time PCR)用于檢測轉染后PTHrP基因的RNA表達水平；Western-Blot方法檢測轉染后PTHrP及RANKL的表達水平。
　　結果：轉染12小時后進行的Transwell試驗，顯示各組穿過Transwell人工膜并附著于上層小室底面的細胞，分別進行細胞計數，并進行統(tǒng)計分析。結果顯示PTHrP特異性轉染組（1組、2組、3組）與對照組（4組、5組）相比，穿過人工膜的數量明顯減少，抑制

4、率分別為63.8%、60.3%、66.0%，經單因素方差分析，LSD法組間兩兩比較，結果顯示，實驗組1、實驗組2、實驗組3均和對照組4組及5組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01)，4組與5組間無明顯差異(P＞0.05)；Real-time PCR實驗顯示，實驗組1組、2組及3組的PTHrP基因的表達顯著被抑制，抑制率分別為72%、75%、73%(P＜0.01),而對照組4組與5組之間對比，PTHrP基因的表達并沒有統(tǒng)計學差異；Wester

5、n-Blot實驗顯示，對于PTHrP蛋白，實驗組1組、2組、3組的條帶灰度值之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；4組、5組條帶之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；無論1組、2組還是3組，它們的條帶灰度值與4組、5組對比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而對于RANKL蛋白而言，同樣的，1組、2組、3組的條帶灰度值之間無統(tǒng)計學差異，（P＞0.05）；4組、5組條帶之間無統(tǒng)計學差異，（P＞0.05）；無論1組、2組還是3組，它們的條帶灰度