衣原體質(zhì)粒侵襲細胞相關毒力基因的體外鑒定.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)、擴增和純化沙眼衣原體鼠肺炎株（MoPn）。比較幾種轉化MoPn菌株在體外培養(yǎng)中對宿主細胞的感染力，鑒定與衣原體質(zhì)粒侵襲細胞相關的毒力基因，并比較不同實驗條件對衣原體侵襲和粘附宿主細胞能力的影響；鑒定影響衣原體在宿主細胞與細胞間傳播和生長能力和導致包涵體內(nèi)糖原合成障礙相關的基因。
　　方法：選取Hela細胞為宿主細胞，將攜帶敲除了衣原體質(zhì)粒中不同開放閱讀框（ORF）的各轉化菌株接種培養(yǎng)20～24h,復蘇成功后不斷擴增

2、收集。采用泛影鈉-泛影葡胺密度梯度離心法進行菌株的純化；測定各菌株濃度，按相同的菌量接種，設定離心+二乙胺乙基葡聚糖(DEAE-D)、離心、DEAE-D、無任何處理四個接種條件，在不同的實驗條件下分別對各菌株進行處理，利用間接免疫熒光顯微鏡計數(shù)包涵體數(shù)目；分別于（20、40、60 h）觀察各菌株連續(xù)3代感染細胞后菌斑形成的速度與面積大??；采用Lugol碘液染色，在倒置顯微鏡下，觀察各菌株包涵體內(nèi)糖原的合成情況。
　　結果：純化后獲

3、得了高感染活性的沙眼衣原體原體（EB）。敲除質(zhì)粒編碼蛋白Pgp4的菌株pGFP::CMΔPgp4在4種條件下包涵體數(shù)目分別為（10.20±1.30）、（6.80±0.44）、（3.00±1.22）和（0.80±0.45）個，陰性對照組質(zhì)粒缺失株CMUT3包涵體數(shù)目分別為（6.40±0.89）、（3.80±0.83）、（1.60±0.89）和（0.60±0.54）個，同一條件下兩者均表現(xiàn)出相近的感染能力，包涵體數(shù)目均低于同一條件下其他菌株

4、（均P<0.01）；同一菌株在不同條件下，包涵體數(shù)目差異具有統(tǒng)計學意義（F=845.310，P<0.01）；各菌株在離心+DEAE-D條件下包涵體數(shù)目最多；菌株pGFP::CMΔPgp4和質(zhì)粒缺失株連續(xù)3代感染細胞時菌斑形成的速度和面積大小均低于其他菌株；并出現(xiàn)糖原累積的障礙。
　　結論：超速低溫密度梯度離心純化能夠去除細胞中其它細胞成分對實驗結果的影響，較既往常規(guī)的純化方法更能保證結果的可靠性。Pgp4是衣原體質(zhì)粒侵襲細胞相關的