衣原體立克次體

1、第十八章支原體、 衣原體、立克次體,第一節(jié)支原體是一類缺乏細(xì)胞壁、形態(tài)上呈高度多形性，能通過除菌濾器，在無生命培養(yǎng)基中能生長繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物。由于它們能形成有分支的長絲，故稱之為支原體。,支原體科分支原體屬和脲原體屬兩個屬。對人致病的主要為肺炎支原體、人型支原體、生殖器支原體、穿通支原體和溶脲脲原體。除此之外，支原體還經(jīng)常污染細(xì)胞培養(yǎng)，給實(shí)驗(yàn)室病毒分離、單克隆抗體制備等工作帶來一定困難。,一、肺炎支原體,感染呈全球性

2、分布，主要侵犯呼吸系統(tǒng),借滑行運(yùn)動穿過粘膜上皮細(xì)胞纖毛屏障，主要粘附因子為一類對胰酶敏感的表面蛋白，稱Pl蛋白。,是青少年急性呼吸道感染的主要病原體，表現(xiàn)為上呼吸道感染綜合征，占非細(xì)菌性肺炎的1／3以上。過去認(rèn)為是溫和的病原體，現(xiàn)在認(rèn)為它也可引起嚴(yán)重的雙側(cè)肺炎和其他系統(tǒng)的肺外并發(fā)癥，如心肌炎、心包炎、免疫性溶血性貧血、腎炎等。,微生物特性,1．形態(tài)與結(jié)構(gòu) 類似酒瓶狀，沒有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。G-易著色，Giemsa染色呈淡紫色。細(xì)胞膜

3、中膽固醇含量多。所有肺炎2株共同具有P1蛋白，是主要特異性免疫原和血清學(xué)診斷的主要抗原。,2.抗原結(jié)構(gòu) 來自細(xì)胞膜，胞膜外層蛋白質(zhì)是主要抗原， 常用生長抑制試驗(yàn)(GIT)與代謝抑制試驗(yàn) (MIT)鑒定。GIT是將吸有型特異性抗血清 的濾紙片置于接種有支原體的固體培養(yǎng)基上， 經(jīng)孵育出現(xiàn)同型血清抑制該型支原體生長現(xiàn) 象。MIT是將支原體接種在含有抗血清培養(yǎng) 基中，若抗體與支原體型一

4、致，則抑制該支 原體不能分解葡萄糖產(chǎn)酸。此兩種方法可將 支原體分成若干血清型。,3．培養(yǎng)特性 以二分裂繁殖，繁殖較慢；生 長需要膽固醇；反復(fù)傳代后呈“荷包蛋” 狀菌落，可迅速溶解哺乳動物紅細(xì)胞。4．生化反應(yīng) 肺炎支原體可根據(jù)是否能利用 葡萄糖、水解精氨酸和尿素來與其他支原 體進(jìn)行鑒別。,5.抵抗力,1.對熱的抵抗力一般與細(xì)菌相似。耐冷， -70℃或液氮可長期凍存, 4℃放置也不 要超

5、過3天。2.支原體對干燥敏感，干燥的標(biāo)本難以分離出支原體。沒有細(xì)胞壁青霉素不敏感。,檢驗(yàn)程序,1 .標(biāo)本采集 肺炎支原體有粘附細(xì)胞作用，以 咽拭子標(biāo)本為好，取材后宜立即接種。2. PCR法快速、敏感和特異，目前某些臨床實(shí) 驗(yàn)室以特異性引物通過這一技術(shù)從患者痰中 檢測肺炎支原體DNA。 3. 電子顯微鏡觀察無細(xì)胞壁，易與細(xì)菌鑒別。,4.分離培養(yǎng),以牛心消化液為基礎(chǔ),加20％小牛血清及新鮮酵母浸液制成的液體或

6、固體培養(yǎng)基。加入青霉素,可防止雜菌生長。初次分離生長緩慢，在含5％C02下培養(yǎng)，10天長出油煎蛋狀菌落。能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，不能利用精氨酸與尿素，可還原美藍(lán)。分離培養(yǎng)陽性率不高，對臨床診斷意義不大, 但對流行病學(xué)調(diào)查有重要意義 。,5．抗體檢測,(1)ELISA：此法敏感，特異性高，快速、經(jīng)濟(jì)，并可檢測IgM和IgG抗體，為目前診斷的可靠方法。檢測分子量190kDa的P1蛋白，3h可完成試驗(yàn)，特異性高，敏感性為10 4CFU／μl標(biāo)本。,

7、(2)補(bǔ)體結(jié)合(CF)試驗(yàn),試驗(yàn)所用的抗原為氯仿·甲醇提取的糖脂類抗原。雙份血清試驗(yàn)，效價呈4倍增長者，或單份血清效價≥l：128者，80％的病例表明近期有肺炎支原體感染。,(3)間接血凝試驗(yàn),操作簡便，敏感度略高于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，感染發(fā)病后7天出陽性，10-30天達(dá)高峰，12-26周逐漸降低。本試驗(yàn)與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)類似，主要測lgM 抗體，與生殖道支原體之間存在交叉反 應(yīng)。,(4)冷凝集試驗(yàn),是一種非特異性試驗(yàn)。其方

8、法是將患者血清與O型Rh陰性紅細(xì)胞在4 ℃下作凝集試驗(yàn)。有33％—76％肺炎支原體感染者為陽性 (效價≥1：64)。效價越高或雙份血清呈4倍以上升高，肺炎支原體近期感染的可能性越大。,二、解脲脲原體,也稱溶脲脲原體，是1954年Shepard首先從非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道分泌物中分離獲得，因其分解尿素的特性命名為解脲脲原體。在分類學(xué)上屬人支原體科脲原體屬。是人類泌尿生殖道最常見的寄生菌之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)，它與多種疾病有關(guān)，故

9、引起國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的廣泛重視。,1.寄居泌尿生殖道，傳播途徑為性接觸和母嬰傳播。致病機(jī)制與侵襲性酶有關(guān)。吸附后產(chǎn)生磷脂酶分解胞膜中的磷脂，脲酶分解尿素產(chǎn)氨，影響宿主細(xì)胞生物合成。產(chǎn)生IgA蛋白酶，破壞IgA的局部抗感染作用，有利于粘附和致病。,2.引起非淋菌性尿道炎(NGU) ，上行感染，可引起前列腺炎或附睪炎；陰道炎和宮頸炎，并可導(dǎo)致流產(chǎn)。因?yàn)榕c人精子膜有共同抗原，對精子可造成免疫損傷而致不育。,微生物特性,1．形態(tài)結(jié)構(gòu) 在液體培養(yǎng)

10、基中以球形為主，直徑約50-300nm，單個或呈雙排列，能通過微孔濾膜；G-但不易著色，姬姆薩染色呈紫藍(lán)色。無細(xì)胞壁，細(xì)胞膜由三層膜構(gòu)成。內(nèi)、外兩層由蛋白質(zhì)組成，中層為類脂質(zhì)，胞內(nèi)含核糖體和雙股DNA。DNA中Ｇ十C含量為26．9～29．8mol％。,2．培養(yǎng)特性,營養(yǎng)要求較高，需要供給膽固醇和酵母，常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為牛心消化液。37℃生長良好，22℃生長差，42℃不生長，最適pH為5．5-6．5。在含95％N2和5％C02氣體環(huán)境下培

11、養(yǎng)2天形成很小菌落，呈“荷包蛋”樣，放大200倍才能觀察到，故稱T株。生長除膽固醇外，尚需尿素，有脲酶能水解尿素產(chǎn)氨，不分解葡萄糖和精氨酸。,3.抗原構(gòu)造,有脂多糖、脲酶和蛋白質(zhì)抗原，有16個血清型劃分為A、B兩大群，其中以4型引起疾病頻率高。A群各型均含有16kD和17kD多肽；B群各型僅含17kD多肽；而13血清型只含有16kD多肽，以能識別16kD和17kD多肽的單抗，為區(qū)別血清群特異性標(biāo)志。,4．抵抗力,由于無細(xì)胞壁，對滲透作用

12、特別敏感，易被脂類溶媒、清潔劑、酒精、特異性抗體和補(bǔ)體溶解。對熱抵抗力差。在4℃存活約2周左右，—70℃中可存活 2-3年。對青霉素等作用于細(xì)胞壁的抗生素不敏感，對影響胞漿蛋白合成的抗生素敏感：對強(qiáng)力霉素、紅霉素、交沙霉素、白霉素、螺旋霉素、氯霉素、麥迪霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素等敏感。,微生物檢驗(yàn),1．標(biāo)本采集 用無菌瓶收集診斷為非淋菌性尿道炎患者中段尿，慢性前列腺炎按摩后的前列腺液，原因不明的不育癥患者的精液，陰道炎與宮

13、頸炎患者的炎性分泌物，羊水和血液等。尿標(biāo)本以無菌方法取10ml，離心沉渣作接種物。,2．標(biāo)本直接檢查,(1)核酸檢測16個血清型均有460bp的DNA片段。通過對PCR產(chǎn)物的核酸雜交和序列分析，可將各種支原體鑒別分類。鑒于本法敏感性高、穩(wěn)定可靠、快速簡便，將成為臨床快速診斷的重要實(shí)驗(yàn)手段。 DNA探針技術(shù)法敏感，可測出50～100pg的DNA。,(2)ELISA 可測定血清型別，還可測出Ig的類型(IgM、IgG)，較敏感、

14、特異性強(qiáng)，有診斷意義。(3)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(IDT) 檢測抗原提取物和培養(yǎng)物。此法敏感，特異性，不需特殊儀器，易于推廣，可作為臨床感染者病原檢查的特異診斷方法。,3．分離與鑒定,取標(biāo)本O．1～0．2ml接種于pH6．0含有酚紅和尿素的液體培養(yǎng)37℃孵育，顏色由黃變紅者為陽性。陽性者轉(zhuǎn)種于固體培養(yǎng)基上，瓊脂培養(yǎng)基中有尿素、0．05molHEPES緩沖液和MgS04，菌落呈黑褐色易辨認(rèn) ，95％N2～5％C02或微厭氧環(huán)境中作次

15、代培養(yǎng)，以低倍鏡觀察菌落形態(tài)。,經(jīng)形態(tài)和生化反應(yīng)等檢測可作出初步鑒定。只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸。用特異抗血清作MIT和GIT作進(jìn)一步鑒定。,三、穿通支原體,能粘附、穿入淋巴細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞中大量復(fù)制，導(dǎo)致宿主細(xì)胞受損和死亡。能促進(jìn)HIV的復(fù)制和病程的發(fā)展，是艾滋病的輔助致病因素。,為桿狀，一端為尖形結(jié)構(gòu)。營養(yǎng)要求高，菌落呈荷包蛋樣，生長較慢，初代多在10天以上，發(fā)酵葡萄糖，水解精氨酸，但不分解尿素，液體培養(yǎng)基生長時無明顯混濁或

16、沉淀。對紅霉素、四環(huán)素、林可霉素敏感，但對青霉素不敏感。,微生物檢驗(yàn),1．標(biāo)本采集 取材對象是AIDS患者或HIV 感染者。用咽拭子。2．選SP-4培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，37℃溫箱培養(yǎng)， 每天觀察顏色有無變化，若由紅變黃透明 無沉淀，視“培養(yǎng)可疑陽性”，再用濾膜過 濾。濾液轉(zhuǎn)種傳代，當(dāng)培養(yǎng)基顏色再度由 紅變黃，則認(rèn)為“初代培養(yǎng)陽性”。,3.鑒定,生化反應(yīng) (1)培養(yǎng)物接種

17、于含1％葡萄糖的SP-4培養(yǎng)基 (發(fā)酵葡萄糖試驗(yàn))，若能分解它，培養(yǎng)基 顏色由紅變黃。 (2)培養(yǎng)物接種于含有精氨殿(不含葡萄糖) 的SP-4培養(yǎng)基(水解精氨酸試驗(yàn))中，若 能水解它，pH上升。 (3)培養(yǎng)物接種于僅含尿素的SP-4培養(yǎng)基(分 解尿素試驗(yàn))中，觀察 pH變化。,代謝抑制試驗(yàn)(MIT),取104CFU／ml陽性培養(yǎng)物分別加入2支含3ml改良的

18、SP-4培養(yǎng)基中，其中1支加入適量抗Mpe標(biāo)準(zhǔn)血清作為試驗(yàn)管，另1支不加抗血清作為對照管，37℃培養(yǎng)。試驗(yàn)管顏色不變(生長被抑制)，對照管顏色由紅變黃(支原體生長)。生長被杭血清抑制的管為MIT陽性，該培養(yǎng)物則為Mpe，根據(jù)抗血清的型別進(jìn)行Mpe分型。,PCR,用Mpe套式PCR(nPCR)，靶基因?yàn)镸pe的16SrRNA基因特異性片段。Mpe-nPCR最終擴(kuò)增長度為410bp，按試劑盒說明書操作，能擴(kuò)增出特異性MpeDNA，認(rèn)為此法

19、更靈敏、特異、快速的Mpe檢測方法。,抗體檢測,國外學(xué)者在HIV感染者中用ELISA法檢測出大量Mpe抗體，其中無癥狀者的陽性率為20％，有艾滋病者為40％，陰性對照0.3％。,第二節(jié) 衣 原 體,是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生、有獨(dú)特發(fā)育周期、能通過細(xì)菌濾器的原核細(xì)胞型微生物。歸屬于廣義的細(xì)菌范疇。衣原體科包括沙眼衣原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體和家畜衣原體等四種。,一、沙眼衣原體,不僅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系統(tǒng)感染、性病淋巴

20、肉芽腫以及其他器官疾病。近年沙眼衣原體的感染率和危害性已超過淋球菌而居性傳播疾病之首，因而日益受到醫(yī)學(xué)界的重視。沙眼衣原體有沙眼生物變種、性病淋巴肉芽腫生物變種（LGV）和鼠生物變種等3個生物變種。,1．沙眼亞種,(1)沙眼： 通過眼-手-眼途徑直接或間接密切接觸傳 播。由A、B、Ba和C血清型引起。結(jié)膜引 起局部炎癥。有濾泡增生。后期出現(xiàn)瘢痕 及角膜血管翳，影響視力。,(2)包涵體結(jié)膜炎：

21、由B、Ba、D、Da等血清型引起。嬰兒通過 產(chǎn)道感染，引起濾泡性結(jié)膜炎，不出現(xiàn)角 膜血管翳。(3)泌尿生殖道感染： 由D-K血清型引起。在性接觸傳播引起的 非淋菌性泌尿生殖道感染（50％—60％）。 易發(fā)展為持續(xù)感染或無癥狀攜帶者。,2.性病淋巴肉芽腫亞種，由L血清型引起性病淋巴肉芽腫。侵犯腹股溝淋巴結(jié)，引起化膿性淋巴結(jié)炎和慢性淋巴肉芽腫。3.鼠生物變種為鼠間傳播，不侵犯人，與鼠肺炎有關(guān)。,微生物特性

22、,1．發(fā)育周期與形態(tài)染色 衣原體具有特殊的發(fā)育周期。①原體是細(xì)胞外存在形式，卵圓形，有胞壁和擬核, 是發(fā)育成熟的衣原體，具有高度感染性，能吸附于易感細(xì)胞特異受體，增大形成網(wǎng)狀體；②網(wǎng)狀體或稱始體，圓形，二分裂增殖為繁殖型，無感染性。于感染24h后濃縮形成原體，最后細(xì)胞破裂釋放原體，再感染其他細(xì)胞，每個發(fā)育周期約需48—72h。,抗原結(jié)構(gòu),復(fù)雜，有屬、種、型等特異性抗原。 (1)屬特異性抗原：為胞壁LPS，屬特異性補(bǔ) 體

23、結(jié)合抗原，應(yīng)用于血清學(xué)診斷。 (2)種特異性抗原：位于主要外膜蛋白 （MOMP）上，可用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和中和 試驗(yàn)檢測。 (3)型特異性抗原：也位于MOMP上，用單 克隆抗體作微量免疫熒光試驗(yàn)?zāi)茏R別沙眼 體的18個型別。,培養(yǎng)特性,沙眼衣原體專性活細(xì)胞內(nèi)寄生，用6—8d齡雞胚卵黃囊及各種傳代細(xì)肋培養(yǎng)。一般培養(yǎng)48—72h后可在細(xì)胞內(nèi)查到包涵體及原體和始體顆粒。近年多采用細(xì)胞培養(yǎng)衣原體，

24、常用的細(xì)胞株為Hela-299和McCoy。,抵抗力,沙眼衣原體感染材料在37℃條件下，經(jīng)48h左右即失去活力，56℃6 min滅活。-70℃可保存數(shù)年，冷凍干燥可保存30年以上仍有活性。O.1％甲醛或O.5％石炭酸溶液24h殺死沙眼衣原體，2％來蘇僅需5min。紅霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素或青霉素對衣原體有抑制作用。,沙眼和包涵體結(jié)膜炎病人，用拭子在結(jié)膜上穹窿涂擦或取結(jié)膜刮片。性病淋巴肉芽腫：采淋巴結(jié)膿汁，也可取直腸拭子或活檢材料送檢。

25、 用光學(xué)顯微鏡觀察包涵體有診斷意義，特別在眼結(jié)膜、尿道及子宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)典型包涵體更有沙眼衣原體感染的參考。,免疫學(xué)方法,1)免疫熒光檢查：用熒光抗體檢測上皮細(xì)胞內(nèi)衣原體抗原。標(biāo)記抗衣原體LPS抗體，可與所有衣原體反應(yīng)；而抗MOMP抗體有種、型特異性?？稍?h內(nèi)即作出診斷并可分型。2)酶免疫檢測：能在數(shù)小時內(nèi)檢測出衣原體可溶性抗原，并適用于同時檢測大量標(biāo)本。,核酸檢測,1)核酸雜交：用125I標(biāo)記的衣原體rDNA探針檢

26、測宮頸標(biāo)本的敏感性和特異性，與培養(yǎng)相比分別為82.8％和99.4％。2)PCR：具有高度敏感性和特異性。一般按沙眼衣原體7．5kb質(zhì)粒、MOMP序列及16SrRNA基因序列設(shè)計引物。,分離培養(yǎng),將標(biāo)本拭子，用含抗生素的稀釋液制成10％-20％懸液。分離的細(xì)胞有McCoy、HeLa-229細(xì)胞等。置5％CO2下培養(yǎng)。初代分離培養(yǎng)72-96h后傳代或盲傳。有癥狀病人90％標(biāo)本第1代即可見包涵體，而無癥狀病人需傳代后才得到陽性。敏感性為

27、80％-90％，特異性100％，是目前確診最可靠的方法，而且是評價實(shí)驗(yàn)室診斷法的標(biāo)準(zhǔn)。,雞胚培養(yǎng),有細(xì)菌污染的臨床標(biāo)本加適當(dāng)?shù)目股?如鏈霉素、慶大霉素和制霉菌素等)肉湯，在室溫中作用lh后，接種3-4只孵育7天的雞胚卵黃囊，35℃孵育，觀察至13天，收獲卵黃囊涂片，作Gimenez染色，鏡檢原體。,鑒定,1.將細(xì)胞培養(yǎng)蓋片用Giemsa或碘染色鏡檢胞質(zhì)內(nèi)包涵體。Giemsa染色比碘染色敏感，可作為鑒別沙眼衣原體的參考。2.可用型特異

28、性熒光血清鑒定其型別。對于卵黃囊和小鼠分離的材料可用免疫熒光法鑒定原體或補(bǔ)體結(jié)合抗原 。,抗體檢測,目前檢測抗體的血清學(xué)方法在常規(guī)臨床診斷中價值很小。原因是不易獲得雙份血清，而且性傳播疾病的高危人群多有慢性重復(fù)感染，原有的抗體水平較高，因而限制了血清學(xué)方法的診斷價值。方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)、微量免疫熒光試驗(yàn)(MIF)、酶免疫法等。其中CF敏感性和特異性較差，而MIF敏感性和特異性較高。,三、鸚鵡熱衣原體,鸚鵡熱衣原體是鸚鵡熱的病

29、原體，主要引起禽畜感染，也可由動物傳染到人，引起肺炎和毒血癥，亦有引起心內(nèi)膜炎的報道。也有衣原體獨(dú)特的生活周期，包涵體較致密，形態(tài)不一，碘染色陰性，是與沙眼衣原體鑒別要點(diǎn) (沙眼衣原體含糖原，碘染色陽性)。,抗原檢測,1)免疫熒光檢查：以衣原體屬、種或型的單克隆抗體與熒光素結(jié)合后中衣原體抗原的存在，用微量免疫熒光法還可用于衣原體的分型。2)酶免疫法(EIA)檢測：將衣原體單克隆抗體與酶結(jié)合，用于組織或細(xì)胞的染色，槍測衣原體抗原。E1

30、A法比免疫熒光法準(zhǔn)確性略高，且可避免主觀因素的影響。,核酸檢測,1)核酸探針檢測法：將衣原體MOMP基因、特異LPS表位基因，及其他決定鸚鵡熱衣原體抗原的基因片段做成探針，對衣原體DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交或Southern印跡雜交試驗(yàn)，可準(zhǔn)確靈敏測出鸚鵡熱衣原體，也可用于種內(nèi)株系的鑒別。2)PCR： 檢測3種衣原體的MOMP基因序列是簡便、微量、快速、敏感的檢測力法。,分離培養(yǎng),(1)雞胚培養(yǎng)：鸚鵡熱衣原體的分離常用雞胚卵 黃囊接種

31、與傳代，可取得滿意效果。(2)小鼠分離：選擇腹腔接種、顱內(nèi)接種和滴鼻 接種進(jìn)行試驗(yàn)。最具特征性的發(fā)現(xiàn)小鼠嗜眠 和麻痹，脹氣的十二指腸上覆蓋一層薄的粘 性滲出物，全肺葉有實(shí)變。,(3)細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)常用PL細(xì)胞、BHK細(xì) 胞、Vero細(xì)胞等，鸚鵡熱衣原體均能生長。 但直接用于臨床標(biāo)本的分離培養(yǎng)效果不好， 最好先接種雞胚卵黃囊，經(jīng)繁殖后再細(xì)胞培 養(yǎng)容易成功。,抗體檢測,方法有補(bǔ)體

32、結(jié)合試驗(yàn)(CF)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試 (ELISA)等。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：主要用于鸚鵡熱和性病淋巴肉芽腫以及肺炎的試驗(yàn)。CF抗體效價呈4倍增長者可作診斷。一次CF抗體結(jié)果，需效價高于1：64才可能作臨床診斷。,四、肺炎衣原體,肺炎衣原體是衣原體屬中的一個新種，只有一個血清型，是一種重要的呼吸道病原體。主要引起青少年急性呼吸道感染，可引起肺炎、支氣管炎、咽炎和鼻竇炎等。還可引起心包炎、心肌炎和心內(nèi)膜炎。肺炎衣原

33、體性感染與急性心肌梗死和慢性冠心病的關(guān)系，越來越引起人們的注意。,微生物特性,1．有衣原體獨(dú)特的生活周期，原體在電鏡下呈 型的梨形，并有清晰的周漿間隙。2．全基因組測序已完成，與鸚鵡熱衣原體、沙 眼衣原體的DNA同源性≤10％，而不同來 擗TWAR株都具有94％以上的DNA同源性， 其限制性內(nèi)切酶的圖譜相同。其單克隆抗體 與沙眼衣原體及鸚鵡熱衣原體無交叉反應(yīng)。3．用HEp

34、-2和HL細(xì)胞系較易分離和傳代。,抗體檢測,以微量免疫熒光試驗(yàn)(MIF)最為敏感，該試驗(yàn)陽性者50％～70％可分離出 TWAR，用此法檢測特異性的IgM和IgG抗體，有利于區(qū)別近期感染和既往感染，也有利于區(qū)別原發(fā)感染和再感染，TWAR的再感染相當(dāng)常見，特別是老年人，再感染時一般不出現(xiàn)lgM和補(bǔ)體結(jié)合抗體。,第三節(jié) 立克次體,對人致病的立克次體有五個屬立克次體屬、柯克斯體屬、東方體屬、埃立克體屬和巴通體屬。,共同特點(diǎn),①大

35、多是人畜共患病原體，引起人類發(fā)熱和出疹性疾?。虎谝怨?jié)肢動物為傳播媒介或?yàn)閮Υ嫠拗?；③大小介于?xì)菌與病毒之間，光鏡下呈多形態(tài)性，主要為微，桿狀或球桿狀，革蘭陰性；④除了少數(shù)外全是專性活細(xì)胞內(nèi)寄生；⑤菌體內(nèi)同時含有DNA和 RNA兩類核酸；⑥以二分裂方式進(jìn)行繁殖；⑦對抗生素敏感。,一、斑疹傷寒立克次體,(一)臨床意義 1．普氏立克次體是流行性斑疹傷寒(又稱虱傳 斑疹傷寒)的病原體。 病人是惟一的傳

36、染源，體虱是主要傳播媒介， 而非儲存宿主。 傳播方式為虱-人-虱，體虱僅是傳染媒介。,莫氏立克次體,地方性斑疹傷寒(又稱鼠型斑疹傷寒)的病原體。嚙齒類動物是主§宿主，傳播媒介是鼠蚤或鼠虱。鼠蚤叮咬人體時，常排糞于皮膚上，斑疹傷寒立克次體從抓破的傷口進(jìn)入人體。若有人虱寄生，可通過人虱為傳播媒介，繼發(fā)性地在人群中傳播。,致病物質(zhì),有兩種，其一是內(nèi)毒素，主要成分為脂多糖(LPS)；其二為磷脂酶A,能損

37、傷宿主細(xì)胞膜及溶解胞內(nèi)吞噬體膜，以利于病原體穿入宿主細(xì)胞并在其中生長。普氏和莫氏立克次體所致的斑疹傷寒癥狀相似，以高熱、頭痛、全身皮疹為主要特征。伴有神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等癥狀和實(shí)質(zhì)性器官損傷。,(二)微生物特性,1. 比細(xì)菌小，呈多形態(tài)性，在感染細(xì)胞內(nèi)聚 集成團(tuán),分布在胞質(zhì)內(nèi), Gimenez法染色后 呈紅色，外表含有微莢膜結(jié)構(gòu)。2. 必須在真核細(xì)胞內(nèi)才能生長繁殖，培養(yǎng)時 需要C02。通常采用5-9日齡雞

38、胚作卵黃囊接種，于32℃-35℃孵育4～13d內(nèi)死亡，雞胚死亡時間與接種劑量大小呈直接相關(guān)。普氏和莫氏立克次體能在多種單層細(xì)胞上生長繁殖。豚鼠可作立克次體的初代分離。,3.有群特異性和種特異性兩種抗原。大部分立克次體與普通變形桿菌X菌株的菌體耐熱多糖抗原有共同的抗原性，故可用這些菌株代替立克次體抗原進(jìn)行凝集反應(yīng)去檢測抗體，這種交叉凝集試驗(yàn)被稱為外斐反應(yīng)，可供輔助診斷。,外斐反應(yīng),(三)微生物檢驗(yàn),1.標(biāo)本采集(1)病人血液標(biāo)本：發(fā)熱期

39、均有立克次體血癥， 在急性期較易檢出立克次體。爭取在用抗生 素前采血，立即床側(cè)接種。(2)活檢或尸檢材料：肺、肝、脾、淋巴結(jié)、心 瓣膜等標(biāo)本。,2.標(biāo)本直接檢查,(1)免疫熒光檢測 用于臟器檢查。制備標(biāo)本片薄而均勻，組織結(jié)構(gòu)清晰，固定后用熒光抗體染色, 常見脾、肺及心瓣膜中有立克次體，也可在肝、腎及皮疹活檢組織中檢出。(2)核酸檢測 PCR敏感性高，所需樣品量只需ELISA實(shí)驗(yàn)的1／5。以編碼17kD蛋白的基因

40、和編碼普氏和莫氏立克次體169kD蛋白的基因作為擴(kuò)增靶區(qū)。,引物R17-1、-2在65℃條件下能擴(kuò)增普氏和莫氏立克次體DNA。在瓊脂凝膠上產(chǎn)生一條340bp的核酸帶；引物R169-1、-2僅能擴(kuò)增普氏立克次體DNA，產(chǎn)生一條432bp的核酸帶。兩種引物同時使用，擴(kuò)增后普氏可產(chǎn)生340bp和432bp兩條帶，而莫氏只產(chǎn)生340bp一條帶。該法敏感性可達(dá)0．05ngDNA水平，重復(fù)性好，操作方便，對兩型立克次體早期、鑒別診斷以及自然生態(tài)

41、宿主調(diào)查研究具有較大價值。,3．分離培養(yǎng),(1)動物接種 選用健康雄性豚鼠接種以便觀察陰囊腫脹現(xiàn)象。每日測體溫，至40℃發(fā)熱時采血或臟器懸液、接種雞胚卵黃囊或細(xì)胞培養(yǎng)以分離立克次體； 感染莫氏立克次體豚鼠在發(fā)熱1—2日內(nèi)出現(xiàn)陰囊紅腫，解剖可見腹股溝淋巴結(jié)腫大、充血、脾大2-3倍，有腹水；有陰囊反應(yīng)者，睪丸有小出血點(diǎn)，鞘膜充血并有漿液性滲出物等。鞘膜涂片可查到立克次體。,(2)鑒定,用免疫熒光法鑒定感染動物臟器、雞胚卵

42、黃囊、細(xì)胞培養(yǎng)物中的特異性抗原以已知抗原測定動物恢復(fù)期血清中的相應(yīng)抗體。必要時用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、微量凝集試驗(yàn)等，作群和種的鑒定。,(3)分離株繁殖及保存,①雞胚卵黃囊培養(yǎng) 收獲卵黃囊，經(jīng)涂片染色鏡檢, 含立克次體較多而又未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的卵黃囊膜，或?qū)⑵渥鞒蛇m當(dāng)濃度的懸液置-70℃冰箱保存，或冰凍干燥保藏；②細(xì)胞培養(yǎng)：選雞胚、成纖維、人羊膜、HeLa等細(xì)胞，接種培養(yǎng)、鑒定后將立克次體大量繁殖的感染細(xì)胞置-70℃儲存。,4．抗體檢測,立克次體

43、病常用的血清學(xué)診斷方法除外斐反應(yīng)、間接免疫熒光(IFA )試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)外，還有補(bǔ)體結(jié)合(CF)試驗(yàn)、微量凝集(MA)試驗(yàn)、間接血凝(IHA)試驗(yàn)、膠乳凝集(LA)試驗(yàn)等 。,(1)外斐反應(yīng),除Q熱、立克次體痘及羅沙利馬體感染為陰性外，其他為陽性?；颊逴X凝集素上升較晚，在病程2周左右方出現(xiàn)陽性，病程中雙份血清試驗(yàn)，若效價有4倍增長，方有診斷意義。,有些病例在病程中效價不見上升，約15％的經(jīng)疫苗接種

44、后感染斑疹傷寒的病例。有些輕癥斑疹傷寒或某些發(fā)病嚴(yán)重者，其他血清學(xué)試驗(yàn)陽性，但外斐反應(yīng)可為陰性。斑點(diǎn)熱病人外斐反應(yīng)效價通常為OX19高于OX2，但也有OX2較高者。若僅出現(xiàn)OX2陽性，則對診斷斑點(diǎn)熱有特殊意義。,(2)IFA試驗(yàn),為現(xiàn)在診斷立克次體病常用的方法。用已知立克次體抗原(感染雞胚卵黃囊或細(xì)胞培養(yǎng)懸液)制片，以低稀釋度的病人血清初篩，有呈典型立克次體形態(tài)的明亮熒光顆粒者，判為陽性。再將病程早期及晚期血清分別作雙倍或4

45、倍稀釋以測效價，如呈4—8倍增長者可明確診斷。,(3)ELISA,檢測IgM抗體對早期診斷有價值。立克次體抗原吸附于載體。泛影葡胺梯度離心純化抗原為優(yōu)，檢出血清的抗體效價高，紙上ELISA測定抗體，方法簡便。將感染卵黃囊懸液加于玻片(經(jīng)氯仿·甲醇洗凈)上，涼干、固定，加稀釋血清于抗原點(diǎn)上，每張玻片上包括陽性和陰性對照，加酶標(biāo)兔抗人IgM/G于抗原·血清點(diǎn)作用后，將浸透新鮮配制的底物無灰濾紙覆蓋在玻片上約4-6mi

46、n，可見濾紙條上陽性對照點(diǎn)位置顯紫棕色，取下濾紙條(即終止反應(yīng))，觀察是否顯色，與對照比較判定結(jié)果。此法簡便，并可保存實(shí)驗(yàn)記錄。,(4)CF試驗(yàn),CF試驗(yàn)原來是立克次體病血清學(xué)診斷的經(jīng)典試驗(yàn)，雖然敏感性不如IFA和 ELISA，但非常特異。一般在立克次體病發(fā)病一周內(nèi)，血清中即有CF抗體出現(xiàn)，以后逐漸上升，至第3周達(dá)最高峰，然后逐漸降至較低的效價，并可保持幾年不消失，但也有在病后幾周即轉(zhuǎn)陰性者。病人恢復(fù)期血清與斑疹傷寒群及斑點(diǎn)熱群立克次體

47、可溶性抗原試驗(yàn)的陽性結(jié)果，只能說明該群立克次體的感染 。,三、恙蟲病立克次體,又名東方立克次體是恙蟲病的病原體，由恙螨叮咬侵入人體，對人體致病性很強(qiáng)，釋放的毒素樣物質(zhì)是主要致病因素，引起發(fā)熱皮疹全身中毒癥狀，以及全身淋巴結(jié)腫大及各組織器官的血管炎病變。蟲咬處潰瘍形成黑色焦痂，周圍有紅暈等為其特征。為自然疫源性疾病。,(一)微生物特性,1．具有多形性，但以短桿狀為常見。G-,姬姆 薩染色呈紫紅色, Gimenez染

48、色呈暗紅色， 背景為綠色?？梢澡b別恙蟲病立克次體和 其他立克次體。分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，密集于 細(xì)胞核旁。細(xì)胞內(nèi)寄生。,2．培養(yǎng)特性,(1)動物接種：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘液涂片檢查，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量立克次體，尤以腹膜上皮細(xì)胞內(nèi)多見，常密集于細(xì)胞核旁。,(2)細(xì)胞培養(yǎng)：恙蟲病立克次體可以在多種細(xì)胞內(nèi)生長、繁殖，多采用Vero、L929細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞感染需要適宜的溫度和吸附時間，通常以37℃吸附1h

49、，培養(yǎng)32℃為宜，繁殖緩慢，用Vero細(xì)胞培養(yǎng)8—9d，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生長繁殖，在細(xì)胞核旁高度密集，但不侵入細(xì)胞核。,3．抗原成分,恙蟲病立克次體具有耐熱性多糖抗原和特異性抗原。恙蟲病立克次體和變形桿菌OXk株有共同的抗原成分，在Weil-Felex反應(yīng)中，血清與OX，抗原發(fā)生凝集而不與OX19、OX2發(fā)生凝集。,(二)微生物檢驗(yàn),(1)抗原檢測：ELISA間接法是檢測標(biāo)本的特異性抗原或抗體的最常用方法。(2)PCR：可檢出20ng恙蟲

50、病立克次體DNA；套式PCR法可檢出200pg，是目前最為快速、特異、敏感的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，可用于急性期患者的早期診斷。依據(jù)56KD蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因序列選擇引物，進(jìn)行目的 DNA 擴(kuò)增，然后用1．5％瓊脂糖電泳法檢出特異性DNA帶。,(3)分離培養(yǎng),接種小鼠分離病原。將標(biāo)本接種腹腔O．5ml，一般多在7～18天死亡，感染小鼠有明顯癥狀，瀕死前解剖，可見皮下淋巴結(jié)腫大充血，脾腫大，有粘稠的腹腔滲出液，以Giems

51、a染色鏡檢，在靠近細(xì)胞核旁邊可見成堆排列的立克次體。也可接種Vero細(xì)胞、L929細(xì)胞進(jìn)行立克次體分離培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)10—15天，取細(xì)胞涂片，Giemsa染色鏡檢。,(4)抗體檢測,外斐試驗(yàn)：臨床血清學(xué)診斷方法，血清抗體OXk效價達(dá)l：160以上有意義，病程中雙份或多份血清試驗(yàn)，若效價有4倍增高，有診斷意義。由于外斐試驗(yàn)特異性、敏感性低，容易造成誤診或漏診，不應(yīng)作為恙蟲病的診斷方法。,免疫熒光試驗(yàn)：快速敏感特異，可分別檢測患者血清中的抗

52、恙蟲病立克次體lgG、IgM抗體，效價在1：80以上有診斷意義。雙份血清有4倍或以上增長可以確診。,四、貝納柯克斯體,又稱Q熱立克次體，是引起Q熱(疑問熱，指最初不明病因的發(fā)熱)的病原體。傳染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱為傳播媒介，對人感染力特別強(qiáng)，通過接觸、呼吸道、消化道等途徑使人及動物發(fā)生感染。Q熱除有發(fā)熱、頭痛及肌肉痛外，以出現(xiàn)肺炎和肝炎為其臨床特征。慢性Q熱主要表現(xiàn)為心內(nèi)膜炎。,（一）微生物特性,1.形態(tài)與結(jié)構(gòu) 個體

53、較小，多為短桿狀，常排列成對，Gimenez法染色呈紅色，背景呈綠色，用Giemsa法染色呈紫紅色。有莢膜，在雞胚卵黃囊或細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)均可有芽胞形成。2.基因組與抗原成分 基因組分子量為大腸桿菌的1／3；編碼代謝酶、表面抗原與毒力因子有關(guān)基因。有兩相抗原，Ⅰ相為光滑型LPS，Ⅱ相為粗糙型短鏈LPS。,3．培養(yǎng)特點(diǎn),雞胚是培養(yǎng)的極好宿主。一般經(jīng)培養(yǎng)10—12d，1g卵黃囊膜?？色@得約1000μg純凈的立克次體能在多種人和動物的原代或

54、傳代細(xì)胞內(nèi)繁殖。一般不引起明顯的細(xì)胞病變。,4．抵抗力,貝納柯克斯體抵抗力強(qiáng)，70℃ -90℃加熱30—60min尚難殺死。1%福爾馬林作用24小時也不能完全滅活。對氯霉素和四環(huán)素類抗生素敏感。,(二)微生物檢驗(yàn),(1)標(biāo)本直接抗原檢測：免疫熒光法進(jìn)行檢測。(2)標(biāo)本直接核酸檢查：按16SrRNA非保守區(qū)序列合成寡核苷酸探針，能檢出5pgrRNA，如將非保守區(qū)特異性擴(kuò)增，其敏感性可達(dá)檢出1—10個貝納柯克斯體的水平。 用

55、貝納柯克斯休質(zhì)粒DNA片段制備的探針，不僅能快速檢出病原體，且能鑒別含QpHI或QpRS質(zhì)粒分離株，與呼吸道感染病原體DNA無交叉反應(yīng)。試驗(yàn)僅需8—12h即可得到結(jié)果。,3．分離培養(yǎng),病原體分離只是在該地區(qū)尚未證明有Q熱存在，病情特別嚴(yán)重有必要。將標(biāo)本接種于豚鼠或培養(yǎng)細(xì)胞，觀察其發(fā)病與否或生長情況，經(jīng)形態(tài)學(xué)、血清免疫學(xué)等鑒定后作出結(jié)論 。,4．抗體檢測,用間接免疫熒光試驗(yàn)、ELISA和CF試驗(yàn)。 CF試驗(yàn)中抗原相的選擇對結(jié)果影響極

56、大，對現(xiàn)癥診斷主要看Ⅱ相抗體逐漸上升，若Ⅰ相抗體保持較高水平，則往往說明慢性感染或隱性感染。,五、埃立克體,(一)臨床意義為埃立克體病病原體。1.人腺熱埃立克體病 可能由蜱傳播，也 可能由于攝食生魚引起。臨床表現(xiàn)為發(fā) 熱頭痛、淋巴細(xì)胞數(shù)增加，并出現(xiàn)非典 型淋巴細(xì)胞。。2.人單核細(xì)胞埃立克體(HME)病，主要侵 染人的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。傳播媒介 為蜱。,3．人粒細(xì)胞埃立克體(HGE)病 主要侵犯人

57、 粒細(xì)胞。硬蜱是傳播媒介。也是萊姆病 病原體的攜帶和傳播者，故與萊姆病的 相重疊。,（二）微生物特性,1．為G-小球菌，呈多形性，Romanows染 色呈蘭色和紫色。吞噬細(xì)胞以內(nèi)吞的方 式將埃立克體攝入胞內(nèi)，在胞質(zhì)內(nèi)以二 分裂的方式繁殖，形成包涵體。稱為桑 椹體。,2．基因組 埃立克體的16SrRNA基因極保守， 但5’端的50—100堿基

58、為高變區(qū)，適合設(shè)計 PCR引物或核酸雜交探針。人粒細(xì)胞埃立 克體的外膜蛋白44kDa蛋白被克隆，可用 作探針。3．抗原成分 在埃立克體屬內(nèi)的各種埃立克 體均可有血清學(xué)交叉反應(yīng)。,(三)微生物檢驗(yàn),1.標(biāo)本直接顯微鏡檢查 采集病人的外周血制備血片，經(jīng)Giemsa或Wright染色，在光鏡下發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞及單核細(xì)胞質(zhì)或血小板內(nèi)有圓形、深紫色的桑椹體，可作為急性期埃立克體病的一種簡便和有效

59、的輔助診斷方法。,2.核酸檢測,PCR是最有效的埃立克體病的病原學(xué)診斷方法，可用于埃立克體病的早期診斷。大約80％-87％HME和43％-75％的HGE患者的血標(biāo)本被PCR檢測為陽性。 特異性幾乎為100％，主要依賴引物的特異性。可用16SrRNA基因設(shè)計引物或做基因探針。有極高的敏感性，感染后數(shù)天就可檢出陽性結(jié)果。,3.細(xì)胞培養(yǎng),查菲埃立克體可用犬巨噬細(xì)胞系(DH82)，腺熱埃立克體用小鼠的巨噬細(xì)胞系(P388D1)，人粒細(xì)胞

60、埃立克體則用人的粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系(HL-60)作它們的體外培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。將3ml抗凝血的白細(xì)胞層，接種細(xì)胞單層，置 37℃的5％C02孵育箱中培養(yǎng)，每隔3-4天換一次細(xì)胞維持液，并刮少許細(xì)胞涂片，用Giemsa染色，在光鏡下檢查埃立克體包涵體。,4.小鼠接種,從蜱體內(nèi)分離埃立克體讓蜱叮咬小鼠和吸血?；?qū)⒉∪嘶騽游锏目鼓陌准?xì)胞注入小鼠腹腔。觀察小鼠發(fā)病。 定時采小鼠血作涂片染色、IFA、PCR等證明小鼠被埃立克體感染，用腹

61、腔液涂片染色鏡檢包涵體。,5.抗體檢測,(1)間接免疫熒光(1FA)： 將感染血清作倍比稀釋，加入抗原孔內(nèi)， 置濕盒37℃孵育lh；玻片沖洗后，用 Evans藍(lán)作背景染色，然后每孔加一滴固 定液，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢查感 染細(xì)胞內(nèi)的帶熒光的包涵體，通常血清中 抗體滴度 1：20為陽性。若獲雙份血清效 價增高4倍以上即可明確診斷。,(2)免疫印跡 采用免疫印跡檢測埃立

62、克體病患者血清 中抗埃立克體主要抗原組分的抗體，可 以改善血清學(xué)檢測的特異性。經(jīng)免疫印 跡分析發(fā)現(xiàn)HME患者血清中含有抗查菲 埃立克體的44kDa抗原組分的IgG抗體。 但不能用于埃立克體病的早期診斷。,六、漢賽巴通體,引起桿菌性血管瘤—桿菌性紫癜(BAP)和貓抓病(CSD)的病原體。常在免疫缺陷病毒(HIV)感染者發(fā)生，也感染有免疫潛能的人群，與接觸貓有關(guān)。為G-營養(yǎng)要求苛刻的需氧桿菌，為兼性胞內(nèi)寄生菌。

63、,貓抓病有與貓接觸史，抓咬部位形成丘疹膿皰，繼而出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大，約10％病例有肉芽腫性結(jié)膜炎、骨質(zhì)溶解、肺炎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害等。,桿菌性血管瘤-桿菌性紫癜,常在免疫低下者發(fā)生。與貓抓傷咬傷有關(guān)，主要表現(xiàn)為皮膚損害和內(nèi)臟發(fā)生紫癜。在病變處能發(fā)現(xiàn)桿菌狀小體。開始皮膚出現(xiàn)紅丘疹，偶有潰瘍。皮下出現(xiàn)肉色結(jié)節(jié)。桿菌性血管瘤可發(fā)生在任何實(shí)質(zhì)性器官，很難與分枝桿菌和真菌感染或惡性腫瘤鑒別。,(一)微生物特性,1．為G-彎曲的桿狀小體，常呈多形性；

64、初 分離有菌毛，發(fā)現(xiàn)有噬菌體。2．培養(yǎng)特性 營養(yǎng)要求苛刻的需氧桿菌，用 含新鮮血的瓊脂或腦心浸液于35℃5％ C02環(huán)境下培養(yǎng)2—5周才長出灰色凸起 并嵌入瓊脂內(nèi)的菌落。,3．基因組 約為2005kb。已經(jīng)測序的基因 有16SrRNA和 glt A基因序列包括1293 核苷酸，始于ATG起始密碼子，終于 兩TAA終止密碼子。,(二)微生物檢驗(yàn),1.

65、 標(biāo)本染色直接檢查 活檢病理標(biāo)本和淋巴結(jié)活檢用Warthin- Starry染色能查見多形性菌體。2. 核酸檢測 依16S rRNA或gltA基因設(shè)計引物，對臨床標(biāo) 本作 PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)序列測定或用特異 性DNA探針鑒定，可直接作出病原診斷。,3.分離培養(yǎng),可將血液標(biāo)本先經(jīng)溶血和離心處理，待長出菌落后作生化反應(yīng)，分析其細(xì)胞脂肪酸和16SrRNA序列等加以鑒定。于培養(yǎng)1周仍不見生