衣原體堿基切除修復(fù)酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、上海交通大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位論文衣原體堿基切除修復(fù)酶學(xué)性質(zhì)研究關(guān)鍵詞衣原體，DNA糖苷酶，DNA聚合酶I，內(nèi)切核酸酶IV，堿基切除修復(fù)，體外重構(gòu)資金資助：國家自然科學(xué)基金(基金編號30170211)研究方向：DNA修復(fù)申請學(xué)位：博士培養(yǎng)單位：上海交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院學(xué)科專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：劉建華博士生：劉喜朋2005年6月3日采戮瑟擎臻勿壘文公宿～。斷雙鏈DNA和單鏈DNA，產(chǎn)生帶3’羥基與5’脫氧核糖磷酸的缺口。37

2、修復(fù)酶活性可以除去3’末端阻礙DNA聚合酶延伸的fit、p不飽和醛，產(chǎn)生自由羥基，用于DNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)。衣原體內(nèi)切核酸酶Iv還具有作用于雙鏈DNA以及RNA／DNA雜合體RNA鏈(麗非DNA鏈)的37外切核酸酶活性。當雙鏈DNA作為底物時，二價鎂離子是活性必需離子，然而二價鋅離子、銅離子與鎳離子則完全抑制37外切核酸酶活性；3’外切核酸酶活性的最適pH為80105：高濃度NaCl抑制37外切核酸酶活性。37外切核酸酶可作用于雙

3、鏈DNA的3’平滑末端，3’凹陷末端與內(nèi)部缺口的3’末端，以及3’突出端。雙鏈DNA的37末端核苷酸錯配時，仍可被衣原體內(nèi)切核酸酶Iv的3’外切核酸酶活性有效降解，但錯配核苷酸數(shù)多于三個時，降解效率極低；與此相一致，雙鏈DNA37突出端的核苷酸數(shù)目多于3個對，3‘外切核酸酶很難水解突出的3’單鏈DNA。基于衣原體內(nèi)切核酸酶IV特異性切割RNA／DNA雜合體的RNA鏈，我們提出了其3’外切核酸酶的作用機制：衣原體內(nèi)切核酸酶Iv3’外切核酸

4、酶的活性中心由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中一個只結(jié)合DNA鏈，作為切割另一條DNA或RNA鏈的模板鏈；而被切割的DNA或RNA鏈只能結(jié)合在另一個結(jié)構(gòu)域。衣原體DNA聚合酶1只具有DNA模板依賴性的DNA聚合酶與57外切核酸酶活性，無3’外切核酸酶活性。其中，57外切核酸酶活性可以從DNA的5‘凹陷末端、內(nèi)部缺口處的5’端降解DNA；也可降解內(nèi)部缺口處的5’單鏈DNA(57flap結(jié)構(gòu))。由于缺失了37外切核酸酶活性，衣原體DNA聚合酶I延伸37

5、末端核苷酸不配對的模板，引物復(fù)合體的能力大大降低。3’外切核酸酶活性的缺失使得衣原體DNA聚合酶I跨越DNA模板中損傷堿基的能力大大增強，除了可以跨越次黃嘌嶺、脫氧尿嘧啶與8一氧鳥嘌呤外，衣原體DNA聚合酶I還可以跨越脫氧核糖(525％)與四氫呋哺(875％)兩種無堿基位點；而具有37外切核酸酶活性的大腸桿菌DNA聚合酶I不能有效跨越脫氧核糖(12％)與四氫呋喃(12’4％)。與正常DNA模板相比，衣原體DNA聚合酶I跨越次黃嘌呤、脫氧

6、尿嘧啶與8氧鳥嘌呤的最大反應(yīng)速率沒有明顯變化，但K。增大了60％；跨越兩種AP位點的最大反應(yīng)速率極大降低，且K。明最增高。由于衣原體基因組中只有DNA聚合酶III與DNA聚合酶1兩種DNA聚合酶，因此DNA聚合酶I很可能負責衣原體的跨越損傷合成，以使衣原體在極端惡劣的環(huán)境條件下存活。3’外切核酸酶活性的缺失使衣原體DNA聚合酶I在DNA合成中喪失了校正功能。衣原體內(nèi)切核酸酶Ⅳ的37外切核酸酶活性可能互補DNA聚合酶I缺失的3’外切核酸酶