肺炎嗜衣原體CPAFm-mAb的制備和沙眼衣原體L2在不同細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)情況.pdf

1、1:
　　目的:制備抗肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protease–like activity factor,CPAF)免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)(181~400aa,CPAFm)基因重組蛋白的單克隆抗體(mAb),并用此mAb建立ELISA方法,檢測(cè)臨床咽拭子標(biāo)本,評(píng)價(jià)該mAb在Cpn早期感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值,為制備Cpn感染快速診斷試劑盒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、>　　方法:通過(guò)查閱文件并利用生物信息學(xué)軟件,篩選CPAF免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)基因,以Cpn CWL029株基因組DNA為模板,高保真PCR擴(kuò)增目的基因,構(gòu)建pGEX6p-2/CPAFm重組質(zhì)粒;將重組目的基因轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,經(jīng)IPTG大劑量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,利用GST親和層析法純化重組蛋白,采用SDS-PAGE和Western-blot分析和鑒定產(chǎn)物;并在核酸蛋白分析儀中測(cè)定純化的蛋白濃度;用純化的CPAFm重組蛋白免疫6只BALB

3、/c小鼠,用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中特異性抗體效價(jià);取血清抗體效價(jià)高的小鼠的脾細(xì)胞,利用細(xì)胞融合技術(shù),與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,制備雜交瘤細(xì)胞,利用間接ELISA法篩選分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株;采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞株連續(xù)篩選3次,并進(jìn)行單克隆擴(kuò)大培養(yǎng);體內(nèi)誘生腹水法制備腹水型mAb,硫酸銨沉淀法純化,ELISA法和Western-blot法檢測(cè)mAb免疫反應(yīng)性和效價(jià),用mAb亞類(lèi)測(cè)定試劑盒檢測(cè)mAb的類(lèi)型;建立ELISA法

4、檢測(cè)Cpn標(biāo)準(zhǔn)株和臨床呼吸道患者咽拭子中的Cpn抗原。
　　結(jié)果:pGEX6p-2/CPAFm重組質(zhì)粒在 E.coli BL21中經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了相對(duì)分子量(Mr)約為51kDa的目的蛋白;目的蛋白以包涵體形式大量表達(dá)。復(fù)性后經(jīng) GST純化試劑盒純化,獲得純度在95％以上的目的蛋白。用純化后的目的蛋白免疫小鼠,間接 ELISA法檢測(cè)血清中特異性抗體,其效價(jià)達(dá)到1:16000以上。取血清抗體效價(jià)高的小鼠脾細(xì)胞,采用細(xì)胞融合技術(shù)

5、,與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0融合,制備出穩(wěn)定分泌 mAb的4株雜交瘤細(xì)胞,分別命名為8E3、9G4、13D1和13D10。采用體內(nèi)誘生法大量制備腹水型mAb,并用飽和硫酸銨沉淀法純化,經(jīng) Western blot鑒定,腹水型 mAb與CPAFm重組蛋白發(fā)生免疫反應(yīng),經(jīng) mAb亞類(lèi)測(cè)定試劑盒測(cè)定,雜交瘤細(xì)胞株8E3和13D1分泌的mAb為IgG1,13D10和9G4分泌的mAb為IgG2b。用自制腹水型 mAb采用 ELISA法檢測(cè)55

6、0份臨床咽拭子標(biāo)本,沒(méi)有檢測(cè)出陽(yáng)性標(biāo)本,而同時(shí)用 PCR檢測(cè)出7例陽(yáng)性標(biāo)本。
　　結(jié)論:
　　1)4株雜交瘤細(xì)胞株分泌的mAb均為IgG類(lèi)抗體,能識(shí)別CPAFm重組蛋白和CPAF的天然抗原表位,具有良好的特異性;
　　2)自制腹水型mAb效價(jià)較低,可能是導(dǎo)致用此mAb建立的ELISA方法靈敏度低的原因之一
　　摘要2:
　　目的:研究沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)血清型 L2

7、在體外培養(yǎng)中的繁殖規(guī)律,探討 L2在體外連續(xù)培養(yǎng)的方法,初步確定 L2在體外培養(yǎng)的最佳生長(zhǎng)發(fā)育條件,為臨床標(biāo)本中 L2的分離培養(yǎng)和進(jìn)一步研究 L2的相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:用沙眼衣原體 L2分別感染人喉癌細(xì)胞(Human Epidermoid Carcinoma-2, HEp-2)、人宮頸癌細(xì)胞(Henrietta Lacks strain of cancer cells, HeLa229)、人肝癌細(xì)胞株 hepG-2(Hu

8、man hepatoma cell line, HepG-2)、胃癌細(xì)胞(SGC-7901)和非洲綠猴腎異倍體細(xì)胞(Vero cells),熒光抗體染色,熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)不同時(shí)間后包涵體的形態(tài),比較其在不同細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)情況,比較不同細(xì)胞對(duì) L2的敏感性。同時(shí)分別設(shè) DEAE葡聚糖處理組與非處理組,放線菌酮處理組與非處理組,通過(guò)比較培養(yǎng)12h、24h、36h和48h后包涵體形態(tài)及 RT-PCR定量檢測(cè)的核酸量,判斷 DEAE和放線菌酮

9、對(duì)沙眼衣原體血清型 L2生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果:在感染24h后,光學(xué)顯微鏡下觀察到 HEp-2細(xì)胞、Vero細(xì)胞、HepG-2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中均不同程度腫脹,5種細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)包涵體,大約40~48h后包涵體占據(jù)整個(gè)胞漿。熒光抗體染色法和RT-PCR結(jié)果顯示5種細(xì)胞中 HeLa細(xì)胞感染率最高,HepG-2細(xì)胞感染率最低,L2在 HeLa細(xì)胞中生長(zhǎng)速度最快;熒光顯微鏡下進(jìn)行包涵體計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn) DEAE葡聚糖預(yù)處理組和對(duì)照組

10、中 L2的感染率和生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有明顯區(qū)別。放線菌酮組中各細(xì)胞內(nèi) L2生長(zhǎng)速度較對(duì)照組快,Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示放線菌酮組各細(xì)胞內(nèi) L2核酸量較對(duì)照組高。
　　結(jié)論:
　　1)沙眼衣原體 L2可感染 HEp-2細(xì)胞、Vero細(xì)胞、HepG-2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞,不同細(xì)胞對(duì) L2敏感性不一樣,并且在不同細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)情況也有明顯差異;
　　2)放線菌酮對(duì) L2包涵體的形態(tài)和密度有影響;