實驗課件(苯甲醇、苯甲酸、水揚酸酸測定)

1、2024/4/1,苯甲醇、苯甲酸、水楊酸的毛細(xì)管電泳分離,教師 肖艷玲,08級綜合實驗 2010.10,2024/4/1,一、實驗?zāi)康模?1、掌握毛細(xì)管電泳的基本概念；2、通過實驗熟悉毛細(xì)管電泳儀的基本原理和操作；3、了解影響毛細(xì)管電泳分離的主要操作參數(shù)。,2024/4/1,二、基本概念：,電泳：在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電

2、荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。,,利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。,高效毛細(xì)管電泳:( CE, capillary electrophoresis)，以毛細(xì)管為分離通道（用75um內(nèi)徑石英毛細(xì)管），以高壓直流電場為驅(qū)動力，以樣品的多種特性為分離依據(jù)的分析技術(shù)?！咝?xì)管電泳。,2024/4/1,電滲流現(xiàn)象,電滲流：毛細(xì)管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動 ，來源于外加電場對管

3、壁溶液雙電層的作用 電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡稱EOF）。,電滲現(xiàn)象: 當(dāng)液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象.,2024/4/1,HPCE中電滲流的大小與方向,電滲流的大小: 用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強度E。即 ν電滲流 = μ E,淌度：取決于帶電離子在單位電場下的遷移速度

4、； 是特征常數(shù) 淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。,2024/4/1,電滲流的作用：,電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性， 如同改變LC中的流速；在HPCE中，控制電滲流非常重要。,電滲流的方向: 取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正

5、電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；,2024/4/1,分離過程,電場作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。,帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。 正離子：兩種效應(yīng)的運動方向一致，在負(fù)極最先流出； 中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出； 陰離子：兩種效應(yīng)的運動方向相反。ν電滲流 >ν電泳時,陰離子在負(fù)極最后流出。在這種情況下,不但可以按類分離, 同

6、種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。,（動畫）,2024/4/1,三、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)基本原理,1.遷移時間（保留時間） HPCE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。,V—外加電壓；L—毛細(xì)管總長度；2.分離效率（塔板數(shù)） 在HPCE中，僅存在縱向擴散，σ2=2Dt,擴散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。,2024/4/1,3.分離度,影響

7、分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計算：,2024/4/1,高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進(jìn)：,電壓升高，電場推動力大； 柱徑小，柱長增加。 高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。,一、采用了 75um 內(nèi)徑的毛細(xì)管；二、采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。,2024/4/1,高效毛細(xì)管電泳法的特點,1.儀器簡單、易自動化

8、 電源、毛細(xì)管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高 在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；3.操作方便、消耗少 進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行；4.應(yīng)用范圍極廣 有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護、材料等；,2024/4/1,四、儀器結(jié)構(gòu)及主要部件,紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-

9、21 mol/L）,1. 高壓電源2. 毛細(xì)管柱3. 緩沖液池4. 檢測器,2024/4/1,1.高壓電源,（1）0～30 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統(tǒng)；,2. 毛細(xì)管柱（1）材料：石英（分離柱不涂敷任何固定液）各項性能好；（2）規(guī)格：內(nèi)徑 20～75μm，外徑350～400μm；長度≈1m,2024/4/1,3.緩沖液池,化學(xué)惰性，機械穩(wěn)定性好；4. 檢

10、測器 要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測； 檢測器、數(shù)據(jù)采集與計算機數(shù)據(jù)處理一體化；,類型 檢測限/mol 特點紫外 10-13～10-15 光譜信息熒光 10-15～10-17 靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光 10-18～10-20 靈敏度極高，樣品需衍生,2024/4/1,1. 離子分析

11、analysis of ion2. 藥物分析analysis of pharmaceutics3. 氨基酸分析analysis of amino acids4. 核酸分析及DNA測序analysis of nucleic acids and sequence of DNA5. 新進(jìn)展及熱點問題advances and special topics,高效毛細(xì)管電泳應(yīng)用與進(jìn)展,2024/4/1,1. 離子分析,202

12、4/4/1,2. 藥物分析,檢測體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析； 尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段； 采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物；,2024/4/1,3. 氨基酸與蛋白質(zhì)分析,可分離23種丹?；被?；HPCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀；問題：吸附和檢測；,蛋白質(zhì)分析,2024/4/1,4. 核酸分析及DNA排序,2024/4/1,五、操作步驟,1.打開計算機和主機，預(yù)熱 3

13、0min。2.雙擊 32Karat 7.0工作界面，選擇進(jìn)入 UV 檢測項。3.切換至工具欄里的 Direct Control 選項，按下 Load，并將樣品按照匹配程序的位置放置。（注意：①毛細(xì)管對準(zhǔn)樣品管口 ②向瓶中裝樣時，樣品不應(yīng)過滿，也不能沾濕瓶頸。）4.在工具欄里選擇 Time Program 選項，對以下將要進(jìn)行的步驟進(jìn)行編寫。,2024/4/1,5.按下工具欄里的藍(lán)色箭頭（Single Run），運行儀器。