3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆與表達.pdf

1、3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)是菊酯類農(nóng)藥生物降解途徑中的第一個代謝產(chǎn)物。3-PBA的半衰期較菊酯類農(nóng)藥更長(180d)，生物毒性更大，研究證實3-PBA具有抗雌激素的特性，可紊亂生物體內(nèi)分泌代謝。因此開展3-PBA的生物降解研究，克隆降解基因，對保障生態(tài)安全有重要意義。
　　本研究以實驗室分離的菊酯農(nóng)藥降解菌株4-D為出發(fā)材料，構(gòu)建4-D菌基因組文庫，以3-PBA為唯一碳源的無機鹽平板為篩選平板，通過混合池馴化篩選獲得可以3-P

2、BA作唯一碳源的重組菌4D-3-4，通過測序比對并分析插入片段，經(jīng)ORF分析得到921 bp的完整閱讀框，該核苷酸序列命名為D34(Genebank登錄號為KR024742)，經(jīng)過Blast比對和生物軟件分析，其應為鄰苯二酚雙加氧酶，是4-D菌降解3-PBA過程中起主要作用的基因。
　　運用Swiss-Model對該基因編碼產(chǎn)物進行了氨基酸結(jié)構(gòu)分析和三級結(jié)構(gòu)預測。氨基酸序列長度為306aa，Aligned蛋白數(shù)量為47，PDB結(jié)合

3、結(jié)構(gòu)數(shù)量為13，該蛋白不含二硫鍵，具有兩個結(jié)構(gòu)域，酶活位點位于第一結(jié)構(gòu)域，第二結(jié)構(gòu)域與蛋白折疊和跨膜相關，其正確折疊需要Ca2+參與。
　　根據(jù)D34完整閱讀框序列設計引物，并在引物兩端分別加上NdeⅠ和HindⅢ識別位點，以原始菌株基因組DNA為模版，成功克隆到921 bp的D34基因序列。以pET-21b為載體，BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建了D34基因的非融合原核表達載體，并進行了誘導表達。對重組表達菌株進行了3-PBA的