擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解基因estaA的可溶性原核表達(dá)及3-苯氧基苯甲酸的降解初探.pdf

1、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是目前使用廣泛的有機(jī)農(nóng)藥之一。3-苯氧基苯甲酸是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解的中間產(chǎn)物，其生物學(xué)毒性和遷移率較菊酯類農(nóng)藥大。我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對擬除蟲菊酯農(nóng)藥的依賴程度與日俱增，其直接結(jié)果是導(dǎo)致由該農(nóng)藥殘留及其降解產(chǎn)物所產(chǎn)生的環(huán)境問題日益嚴(yán)重，因此，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物的生物降解已成為環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　 本研究以課題組前期克隆得到的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解基因estA(genbank:DQ906143)為出

2、發(fā)基因，構(gòu)建誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，獲得可溶性蛋白，并通過優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值相關(guān)應(yīng)用參數(shù)。對于探索本實(shí)驗(yàn)室前期篩選所得的擬除蟲菊酯降解菌4-D對該農(nóng)藥降解產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸降解性能的研究，為后期獲得3-PBA降解相關(guān)基因及構(gòu)建多降解酶基因表達(dá)載體及工程菌提供可行性論證。研究結(jié)果表明:
　　 成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pMAL-c2X-estA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)，獲得酯酶estA基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng);通過SDS-P

3、AGE凝膠電泳、以α-乙酸萘酯為底物的酶活性檢測及Westernblot方法，確認(rèn)外源蛋白EstA在大腸桿菌宿主菌中成功表達(dá)并具有酯酶活性;在無Ca2+參與誘導(dǎo)的情況下可溶性表達(dá)也能進(jìn)行;菌體細(xì)胞液中含有可溶性EstA蛋白及部分不可溶的包涵體蛋白，后者為誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，奠定了基礎(chǔ);
　　 含pMAL-c2X-estA質(zhì)粒的重組基因工程菌可溶性原核表達(dá)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，其最佳誘導(dǎo)條件是:Ca2+濃度1mM，誘導(dǎo)初始OD6

4、00為0.7，誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.1mM，誘導(dǎo)時(shí)pH為7，最佳誘導(dǎo)溫度為26℃，誘導(dǎo)時(shí)間17.5h。優(yōu)化后的酯酶酶活較未優(yōu)化前可提高近2倍;
　　 3-苯氧基苯甲酸的降解實(shí)驗(yàn)表明:在使用高效液相色譜進(jìn)行3-PBA檢測的過程中，直接采用乙腈作為提取液，與樣品以1∶1比例混合均勻，經(jīng)過濾處理直接上機(jī)檢測，所得結(jié)果符合線性關(guān)系，且重復(fù)性好;實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的一株可降解擬除蟲菊酯農(nóng)藥的4-D菌株在12d內(nèi)對250mg/L的3-苯氧基