基于基于抗原抗體反應(yīng)的檢測方法

1、免疫學(xué)檢測原理,第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng) 的檢測方法,學(xué)習(xí)目的 ：一、掌握抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的特點二、了解影響抗原-抗體反應(yīng)的因素三、學(xué)習(xí)抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測方法,,抗原-抗體反應(yīng)： 指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。,主要應(yīng)用：用已知抗原檢測未知抗體用已知抗體檢測未知抗原定性或定量檢測體內(nèi)各種大分子 物質(zhì)用已知抗體檢測某些藥物、激素和 炎性介質(zhì)等各種半抗原物質(zhì),,一

2、、抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的特點,高度特異性定義：一種抗原通常僅能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體 結(jié)合。分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體的抗原結(jié)合部位間存在 分子結(jié)構(gòu)的互補性，二者可特異性結(jié)合。交叉反應(yīng) 共同抗原決定基刺激機體產(chǎn)生的抗體分別與兩種抗原 ( 共同抗原 ) 結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。機理：具有相同的抗原表位,,,抗原-抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見性前帶現(xiàn)象：抗體過剩

3、 后帶現(xiàn)象：抗原過剩網(wǎng)格復(fù)合體：抗原、抗體的數(shù)量比例合適。 反應(yīng)體系基本不存在游離的抗原或抗體，形成肉眼可見的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。,可逆性 抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價鍵結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。,,過剩方結(jié)合價未被完全占據(jù)，成游離小分子復(fù)合物或解離，不可見,,二、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素,內(nèi)因：1）抗體的特異性和親和力 2）抗原理化性質(zhì)、抗原表位多寡和種類

4、 3）抗原抗體的濃度、比例 （影響最大，決定因素）外因：1）電解質(zhì) 使抗原-抗體復(fù)合物失 去電荷而凝集，出現(xiàn)可見反應(yīng) 2）酸堿度 最適pH6～8 3）溫度 適宜（可增加抗原 與抗體的碰撞機會，加快結(jié)合速度）,,三、抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測方法,,凝集反應(yīng)：細(xì)菌或紅

5、細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)出現(xiàn)凝集。沉淀反應(yīng)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后， 在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的沉淀。補體參與的反應(yīng)：應(yīng)用抗體與紅細(xì)胞表面抗 原結(jié)合，激活反應(yīng)體系中的補體成分， 根據(jù)溶血現(xiàn)象判定試驗結(jié)果。免疫標(biāo)記技術(shù)：用熒光素、酶、 放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo) 記抗體或抗原，進行抗原-抗體 反應(yīng)的檢測.,,,,單向免疫擴散：,,特點：定性半定量,用途：可用于測定血清IgG Ig

6、M IgA 和C3等的含量,原理：沉淀環(huán)的直徑與抗原含量呈正相關(guān),操作：鋪板 ↓ 打孔 ↓加樣 ↓放濕盒 ↓看結(jié)果,,雙向免疫擴散,用途：鑒定兩種抗原是否相同,特點：定性半定量,操作：鋪板 ↓ 打孔 ↓加樣 ↓放濕盒 ↓看結(jié)果,,免疫電泳,常用于血清蛋白的組分分析,,在一定量的抗體中，分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時間后形成

7、抗原抗體復(fù)合物，用濁度計測量反應(yīng)液體的濁度，并與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，由此推算樣品中的抗原含量。,免疫比濁,原理：抗體濃度（高濃度）固定時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。,,免疫標(biāo)記技術(shù)：,（1）免疫熒光法,（2）酶免疫測定,（3）放射免疫測定法,（4）化學(xué)發(fā)光免疫分析,（5）免疫印跡法,,（1）免疫熒光法,優(yōu)點:特異性高缺點:檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。,間接熒光法優(yōu)點:敏感度比直接法

8、高，制備一種熒光素標(biāo)記的二 抗即可用于多種抗原的檢測。缺點：非特異性反應(yīng)亦增強。,直接熒光法,熒光素與抗體連接，再與抗原反應(yīng)（對抗原定性或定位）,,（2）酶免疫測定 將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效 性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)：測定可溶性抗原或抗體。,免疫組化技術(shù)：應(yīng)用標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對組織或細(xì)胞表面抗原進行定

9、性、定量、定位。,雙抗體夾心法間接法酶聯(lián)免疫斑點實驗 ELISPOTBAS-ELISA（生物素-親和素系統(tǒng)）,,雙抗體夾心法：用于檢測特異性抗原。,操作步驟： 用已知抗體包板→ 洗滌→ 封板→ 洗滌→ 加入待檢標(biāo)本→ 洗滌→ 加酶標(biāo)抗體→ 洗滌→ 加底物顯色→ 結(jié)果觀察,,間接法：用于檢測特異性抗體。,基本步驟：用已知抗原包板→洗滌→加入待檢抗體→洗滌→加酶標(biāo)二抗→洗滌→加底物顯色→觀察結(jié)果,,酶聯(lián)免疫斑點實驗,A

10、: 用已知抗原檢測分泌特異性抗原的B細(xì)胞：,,用已知抗原包被固相載體，B細(xì)胞分泌的抗體與之結(jié)合，加入酶標(biāo)記的第二抗體，通過底物顯色反應(yīng)可檢測B細(xì)胞分泌的特異性抗體。,,B:用抗細(xì)胞因子抗體檢測細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子：,用抗細(xì)胞因子抗體包被固相載體，加入不同來源的細(xì)胞，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與包被抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體，通過底物顯色反應(yīng)測定結(jié)合在固相載體上的細(xì)胞因子。,,BAS-ELISA 生物素-親和素系統(tǒng),借助所形成

11、的親和素-生物素-酶復(fù)合物追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)抗體或抗原。,原理：生物素與親和素的高度親和力、 生物素能與抗體結(jié)合,,,（3）放射免疫測定法,用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進行免疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性。,（4）化學(xué)發(fā)光免疫分析,將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)回復(fù)至