基于禽傳染性支氣管炎病毒多抗原表位串聯(lián)蛋白的血清抗體ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、傳染性支氣管炎病毒(IBV)是引起禽傳染性支氣管炎(IB)的病原體，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗的使用是預(yù)防IB發(fā)生的重要的措施，快速準(zhǔn)確的病原和抗體檢測(cè)是IB臨床診斷與疫苗預(yù)防效果評(píng)估的必要手段。為提高IBV檢測(cè)的敏感性和特異性，降低檢測(cè)成本，本文開展了以下研究:
　　以嗜腎型IBV SC021202株為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)在不同IBV毒株間廣泛保守的膜蛋白（M蛋白）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示M蛋白氨基端100位氨基

2、酸存在連續(xù)跨膜區(qū)，而B細(xì)胞抗原表位主要分布在羧基端125個(gè)氨基酸區(qū)域。應(yīng)用RT-PCR方法獲取M蛋白去除氨基端連續(xù)跨膜區(qū)的截短體片段并連接到原核表達(dá)載體pET-28a上，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化、小鼠免疫和單克隆抗體的制備過(guò)程。取免疫小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合培養(yǎng)，同時(shí)以ELISA和IFA方法篩選陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)孔并進(jìn)行一系列亞克隆，最終篩選出能夠穩(wěn)定分泌特異性識(shí)別IBV M蛋白的三株單克隆抗體細(xì)胞株，命名為IB1，2B3和6C1。三株單抗

3、的細(xì)胞培養(yǎng)上清及小鼠腹水均可與原核和真核表達(dá)及病毒粒子中的M蛋白反生特異性反應(yīng)，腹水的ELISA反應(yīng)效價(jià)均超過(guò)1.3×107。IBV M蛋白單克隆抗體的制備為IBV抗原的檢測(cè)及基礎(chǔ)研究提供了良好的工具。
　　利用生物信息學(xué)軟件對(duì)IBV SC021202株結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。根據(jù)IBV蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域，結(jié)合參考已鑒定的抗原表位分布情況，同時(shí)兼顧蛋白的親水性、柔韌性、表面可及性及空間折疊情況等性質(zhì)，選取

4、了覆蓋IBV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的8段優(yōu)勢(shì)抗原表位富集區(qū)域。應(yīng)用重疊延伸PCR方法將各個(gè)表位串聯(lián)起來(lái)，并在每?jī)蓚€(gè)表位片段間加入柔性肽序列(-GGGGS-)，以降低嵌合表位蛋白表達(dá)及空間折疊的相互影響，將完整嵌合基因命名為IBV EF，構(gòu)建在原核表達(dá)載體pET-28a上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化。純化的EF蛋白可以和IBV陽(yáng)性血清及EF蛋白免疫血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與禽類主要病毒如NDV, IBDV, AIV的陽(yáng)性血清及SPF雞陰性血清反應(yīng)

5、，EF蛋白免疫SPF雞能夠刺激雞體產(chǎn)生IBV特異性抗體。結(jié)果顯示IBV EF蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，能夠大量獲取且成本較低，有應(yīng)用到雞血清中IBV抗體檢測(cè)的潛力。
　　以EF蛋白為包被抗原，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)條件的優(yōu)化，包括蛋白包被濃度，封閉液的選擇，抗體稀釋液的確定，一抗血清及二抗酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)、孵育時(shí)間，顯色時(shí)間的優(yōu)化等，確定了最適反應(yīng)條件。同時(shí)以673份雞血清為樣本將EF ELISA與商品化IDEXX IBV抗

6、體檢測(cè)試劑盒和間接免疫熒光法(IFA)相比較得出，當(dāng)陰性和陽(yáng)性臨界S/P值為0.08時(shí)，EF ELISA與兩種檢測(cè)方法的陰陽(yáng)性符合率均較大，此時(shí)與IDEXX試劑盒比較陽(yáng)性符合率為92.4％，陰性符合率為85.9％，總符合率為89.7％;與間接IFA方法比較陽(yáng)性符合率為88.2％，陰性符合率為99.6％，總符合率為92.2％，確定S/P值0.08為EF ELISA陰陽(yáng)性臨界值。實(shí)驗(yàn)結(jié)論顯示所建立的EF蛋白ELISA血清抗體檢測(cè)方法具有較好