雞傳染性支氣管炎病毒IgY抗體基因的擴(kuò)增及表達(dá).pdf

1、SichuanAgriculturalUniversityMaster，SDegreeDissertationAmplificationandexpressionofIgYantibodygeneagainstavianinfectiousbronchitisvirusZhenzhenDuan(Preventiveveterinarymedicine)DirectedbyYongHuangJune2015中文摘要本研究旨在利用基因工程抗

2、體技術(shù)制備雞傳染性支氣管炎]gY抗體，為雞抗體基因的研究和特異性抗體的制備提供相關(guān)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為雞傳染性支氣管炎的治療及診斷提供幫助。為了擴(kuò)增雞IgY抗體基因全長(zhǎng)序列，本試驗(yàn)首先提取雞脾臟總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照NCBI上公布的雞輕鏈抗體基因序列合成特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出輕鏈ORF序列。由于網(wǎng)上沒(méi)有公布出雞IgY抗體基因的重鏈全長(zhǎng)序列，因此我們根據(jù)已公布出的重鏈恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物分別利用5’RACE和3RACE方法擴(kuò)

3、增后測(cè)序驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的兩段序列通過(guò)DNAStar軟件拼接后找到ORF序列，再次設(shè)計(jì)引物利用重疊PCR方法擴(kuò)增出重鏈OR／：序列。將輕、重鏈擴(kuò)增出的目的條帶分別連接到克隆載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5ct后，選取單菌落搖菌抽取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和PCR雙重驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送往公司測(cè)序。序列結(jié)果顯示擴(kuò)增出的輕鏈ORF序列長(zhǎng)705bp，編碼234個(gè)氨基酸與己公布的序列同源性達(dá)到95％；重鏈ORF序列長(zhǎng)1716bp，編碼571個(gè)氨基酸，其可變區(qū)基因

4、序列符合雞抗體重鏈可變區(qū)基因特征，其恒定區(qū)序列與已公布的雞lgY抗體基因重鏈序列同源性達(dá)到99％。說(shuō)明我們已成功構(gòu)建擴(kuò)增雞IgY抗體基因輕、重鏈序列的方法。為了表達(dá)雞1BV特異性抗體基因序列，首先將30只1曰齡雛雞隨機(jī)分成2組，分別飼養(yǎng)在隔離的動(dòng)物房中。待母源抗體水平下降后，第一組用弱毒疫苗株4／91進(jìn)行免疫，14天后進(jìn)行2免，第二組作為空白組不做處理。一免后每隔7天采集兩組血樣分離血清，間接ELISA法檢測(cè)特異性抗體，待抗體水平明顯升

5、高時(shí)采集兩組雞脾臟，提取總RNA，擴(kuò)增抗體基因。發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)之間的變異非常大，而重鏈變異較小。從免疫雞中挑選出一條抗體基因?qū)⑵涠ㄏ蚩寺∪氡磉_(dá)載體pcDNA31中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA31H和pcDNA31L。將測(cè)序正確的兩種重組載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，然后利用間接免疫熒光、RTPCR、間接ELISA等檢測(cè)方法對(duì)目的蛋白的表達(dá)及其特異性進(jìn)行檢測(cè)。間接免疫熒光結(jié)果顯示在分別轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中均可見(jiàn)綠色熒光，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的細(xì)