雞傳染性支氣管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitism，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起雞的一種高度傳染性呼吸道疾病，IB可以感染所有日齡的雞，能在多種組織細(xì)胞中復(fù)制，引發(fā)呼吸道疾病、腹瀉和產(chǎn)蛋量下降等，給造成養(yǎng)禽生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在這項(xiàng)研究中，通過(guò)制備針對(duì)QX型IBV毒株-Sczy3S1蛋白的單克隆抗體，并用該單克隆抗體對(duì)Sczy3 S1蛋白的抗原表位進(jìn)

2、行定位研究，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)S1蛋白的分子結(jié)構(gòu)和抗原表位結(jié)構(gòu)，為研究表位疫苗和基于表位的診斷試劑提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究首先對(duì)Sczy3 S1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明S1蛋白結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊和轉(zhuǎn)角為主，并有少量無(wú)規(guī)則區(qū)域;含有較多的兩親性α-螺旋和β-折疊區(qū)域，柔性區(qū)域和表面可及性區(qū)域，有較好的免疫原性。選擇抗原性較強(qiáng)的區(qū)域81 aa-422aa，建立了Sczy3 S1原核表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)。擴(kuò)增其核苷酸序列并克隆

3、至pET-32a(+)載體中，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-32-S1轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測(cè)重組表達(dá)蛋白His-S1，成功表達(dá)出了大小約為57.5kDa的重組蛋白。表達(dá)蛋白His-S1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化和誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化后，大量表達(dá)，用HisTrap FF crude親和層析純化，純化效果達(dá)到90％以上。用BABL/c鼠抗Sczy3高免血清與重組蛋白His-S1做Western b

4、lot分析，結(jié)果表明重組蛋白與鼠抗Sczy3高免血清有較好的反應(yīng)性，可用于針對(duì)S1蛋白單克隆抗體的篩選。
　　利用差速離心法純化IBV Sczy3全病毒作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，并用BALB/c鼠高免血清和BALB/c鼠陰性血清建立ELISA檢測(cè)方法。Sczy3病毒免疫BALB/c鼠4次后，取脾臟與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，融合的誘導(dǎo)劑為PEG1500，共進(jìn)行3次融合。融合細(xì)胞首先用Sczy3純化病毒為包被抗原EL

5、ISA檢測(cè)，篩選出Sczy3陽(yáng)性單克隆抗體;Sczy3陽(yáng)性單克隆抗體用重組蛋白His-S1作為包被抗原第二輪His-S1-ELISA檢測(cè)，篩選出針對(duì)Sczy3 S1蛋白的陽(yáng)性單克隆抗體。陽(yáng)性單抗用Sczy3和重組蛋白His-S1經(jīng)過(guò)Western blot方法檢測(cè)，最終獲得了兩株能夠穩(wěn)定分泌IBV S1蛋白單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細(xì)胞株1D5和6A12。用鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒檢測(cè)兩株單克隆抗體均為IgM亞型。與AIV(H5、H

6、9亞型)、NDV ELISA反應(yīng)，mAbs1D5和6A12特異性良好。與其他10株IBV毒株ELISA反應(yīng)，mAbs1D5和6A12具有交叉反應(yīng)性，mAb1D5與CK/CH/SCYA/10I和CK/CH/SCMY/10I的反應(yīng)性低，比6A12交叉反應(yīng)性差。
　　Sczy3的第8代尿囊液病毒接種CEK細(xì)胞，建立Sczy3 CEK細(xì)胞適應(yīng)株Sczy3-C。Sczy3-C第20代測(cè)定TCID50，結(jié)果為10-5.64/0.2 mL。終點(diǎn)

7、法中和試驗(yàn)測(cè)定mAbs1D5和6A12的中和性，mAbs1D5和6A12都具有中和性，mAb1D5的中和效價(jià)為1∶40.6，mAb6A12的中和效價(jià)為1∶44.7。制備出的mAbs1D5和6A12是針對(duì)Sczy3 S1蛋白的中和性單克隆抗體。
　　為了鑒定制備的mAbs1D5和6A12在IBV Sczy3 S1蛋白上所對(duì)應(yīng)的表位，將mAb1D5和6A12作為靶分子包被ELISA板，用噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行生物淘選。經(jīng)過(guò)3輪淘選

8、，每輪增加Tween-20濃度和降低靶分子包被濃度來(lái)增加篩選強(qiáng)度。兩株單抗均隨機(jī)挑選10個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增和ELISA鑒定，陽(yáng)性噬菌體PCR擴(kuò)增獲得核心序列并測(cè)序。mAbs1D5和6A12均獲得3條序列，與Sczy3 S1蛋白比對(duì)序列發(fā)現(xiàn)mAb1D5的共有序列與S1蛋白87-PPQGMAW-93一致，mAb6A12的共有序列與S1蛋白412-IQTRTEP-418一致。同源性分析發(fā)現(xiàn)，87-PPQGMAW-93在分屬8個(gè)基因型32株I

9、BV中變異性較大，特別是與CK/CH/LSC/99I-Type、Proventriculus-Type和TW-Type的差異性較大;而412-IQTRTEP-418在8個(gè)基因型中較保守，與JP-Type的差異較大。原核表達(dá)含有抗原表位的S1蛋白短肽pET-se1(77aa-107aa)和pET-se2(399aa-424aa)，利用mAbs1D5和6A12分別對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，表達(dá)的融合蛋白pET-s