基于hexon蛋白的檢測(cè)禽腺病毒抗體的ELISA方法的建立.pdf

1、禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬?；谙拗菩悦盖袌D譜分析以及血清交叉中和試驗(yàn)，目前可將FAdV劃分為5個(gè)基因型(A-E)，12個(gè)血清型（血清型1-7、8a、8b、9-11）。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV在世界范圍內(nèi)廣泛分布，且不同日齡的家禽均易感。FAdV感染一般引起亞臨床癥狀，而急性感染主要以包涵體肝炎、肝炎-心包積液綜合癥以及肌胃糜爛等為主。自2013年以來，國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)雞群中流行暴發(fā)肝炎-

2、心包積液綜合癥，感染雞群的死淘率可高達(dá)80％，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。然目前對(duì)FAdV尚無有效的疫苗和藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，更缺乏可靠的FAdV血清學(xué)檢測(cè)方法。本研究從禽腺病毒保守基因hexon著手，分別構(gòu)建了GST-hexon和pET-hexon、 pCold-hexon的分段原核表達(dá)載體，進(jìn)行了融合蛋白的純化，并利用純化的融合蛋白建立了檢測(cè)FAdV抗體的間接ELISA方法。
　　1、hexon基因的分段原核表達(dá)及純化<

3、br>　　本研究選取禽腺病毒5個(gè)基因型毒株，通過比對(duì)其hexon蛋白氨基酸序列，選擇比較保守的4段表位，設(shè)計(jì)引物克隆至pGEX-6P-1原核表達(dá)載體中，陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為GST-hexon1、GST-hexon2、GST-hexon3和GST-hexon4。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)的重組蛋白主要在沉淀中以包涵體的形式存在。Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)的重組蛋白只有GST-hexon1與抗FA

4、dV的雞陽(yáng)性血清具有良好反應(yīng)性。進(jìn)而將hexon1片段克隆至pET-32a和pColdⅠ載體中進(jìn)行蛋白可溶性表達(dá)嘗試。經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)產(chǎn)物仍然在沉淀中以包涵體的形式存在。隨即對(duì)包涵體進(jìn)行了純化，蛋白濃度可達(dá)0.5mg/mL。SDS-PAGE以及Western blot分析表明，純化的重組蛋白具有很好的純度及良好的抗原反應(yīng)性。這一純化的hexon1重組蛋白的獲得為進(jìn)一步建立檢測(cè)FAdV抗體的間接ELISA方法提供了材料

5、。
　　2、檢測(cè)FAdV抗體的間接ELISA方法的建立
　　利用純化的hexon1重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)FAdV抗體的間接ELISA方法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，抗原的最佳包被濃度為6.2μg/mL;一抗最佳稀釋度為1∶400，最佳孵育時(shí)間為60min;酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶50000，最佳孵育時(shí)間為45min;顯色時(shí)間為10min。該ELISA的CUT-OFF值為OD≧0.173。特異性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，建立的ELISA與新城疫