抗原抗體反應的應用

1、第七章 抗原抗體反應及應用,第三節(jié) 抗原抗體反應的應用,2024/3/11,第三節(jié) 抗原抗體反應的應用,一、免疫沉淀和免疫凝集二、免疫標記三、免疫定位分析四、抗原抗體反應的其他應用,2024/3/11,一、免疫沉淀和免疫凝集,免疫沉淀和免疫凝集利用抗原與抗體特異性反應的特性對抗原或抗體進行量或質的測定分析，是最經典的血清學方法。 特點：特異、靈敏、快速。,2024/3/11,,溶液中的沉淀反應在體外可溶性抗原與

2、相應抗體形成肉眼看見的沉淀物。在液相中形成的沉淀不容易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于觀察。,2024/3/11,,,環(huán)狀沉淀實驗示意圖,2024/3/11,,2、凝膠中沉淀反應抗原抗體在半透明的半固相介質中進行沉淀實驗。抗原分子與抗體分子在凝膠介質中自由擴散，相遇形成沉淀。以瓊脂擴散實驗較為常用。單向免疫擴散：抗體混于瓊脂中，小孔中加入抗原，抗原向周圍均勻擴散，與抗體形成沉淀環(huán)。可用于定量測定免疫球蛋白和

3、補體的含量等。雙向免疫擴散：抗原和抗體向周圍擴散后可在兩孔之間形成白色沉淀線，可用于抗原或抗體的定性檢測。缺點：時間長，靈敏度低。,2024/3/11,,,免疫雙擴散,2024/3/11,,3、電泳條件下的沉淀反應 a、免疫電泳： 是利用蛋白質在凝膠中遷移率不同1能被分離的特性與免疫擴散結合進行分析的方法，這種方法能提高分辨率和靈敏度。 實驗分二步,先用電泳將抗原各成分依電泳速度不同分開,再進行雙擴散,常用此法進行血

4、清的蛋白種類分析,對于免疫球蛋減少或增多的疾病診斷或鑒別診斷有重要意義。,2024/3/11,,,2024/3/11,,b、對流免疫電泳: 是一種將雙向擴散和電泳技術相結合的檢測方法。即在瓊脂板上, 使抗原和抗體在電場作用下定向移動, 當抗原抗體相遇且二者濃度比例合適時, 即可出現(xiàn)白色沉淀線。,2024/3/11,c、火箭電泳： 單行免疫擴散與電泳結合的一種方法。在已混合有抗體的凝膠上，做一個小孔，加入抗原，電泳后，沿著電

5、泳方向形成火箭型沉淀，沉淀線的高度與抗原量成正比。,,,2024/3/11,,4、免疫凝集： 大的顆粒性抗原如細胞細菌等與相應的抗體結合后能使抗原顆粒發(fā)生凝集，形成肉眼可見的凝集小塊，即為凝集反應。 最常見的凝集反應是紅細胞凝集，即血凝反應。 免疫凝集反應雖然簡便，但受反應靈敏度限制，在實際應用中越來越少。,2024/3/11,二、免疫標記,免疫標記技術：將已知抗體或抗原標記上易顯示的物質（示蹤物），通過檢測標記物反映有

6、無抗原抗體反應，從而間接測出微量的抗原或抗體。目前有四種方法：放射免疫分析法：以同位素為示蹤物，為最靈敏、可靠的免疫標記技術。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）熒光與發(fā)光免疫分析親和標記的免疫分析,2024/3/11,,1、放射免疫分析 原理: 放射性同位素(131I, 或125I)標記Ag或Ab測定Ab或Ag,通過測定放射活性判斷結果。該法常用于測定微量物質: 如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及l(fā)

7、gE等。檢測方法： 液相體系用液體閃爍儀計數； 固相體系用X射線膠片顯影。,2024/3/11,,,放射性同位素標記分析法,,2024/3/11,,2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(1)定義：抗原與抗體吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原與抗體反應后，將固相與液相分離除去游離的抗原或抗體，而結合的抗原或抗體上被標記的酶仍保持活性，催化底物形成有色產物。(2) 測試方法：可目測或用分光光度計比色進行定性或定量檢測。,2

8、024/3/11,,(3)測試過程使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成） 在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應（抗原抗體反應）,2024/3/11,,用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。（酶標抗原抗體復合物的分離） 加入底物后，底物被酶催化變?yōu)?/p>

9、有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析。（顯色反應）,2024/3/11,常用標記的酶及其底物,2024/3/11,,3、熒光與發(fā)光免疫分析 用于標記抗體的熒光化合物有異硫氰熒光素、羅丹明熒光素等，適用于抗原細胞與組織的定位分析。 時間分辨熒光免疫分析法： 原理：稀土銪離子Eu3+螯合物標記抗體后，抗體與 固相抗原結合，抗體上的Eu3+在紫外光（340nm）激發(fā)下，與增強液中的

10、β-二酮體重新形成一種微膠體螯合物，發(fā)出長壽命的高強度熒光（613nm），比未激發(fā)時增強了100萬倍，可用時間分辯熒光計記錄。,2024/3/11,,,2024/3/11,,4、親和標記的免疫分析 親和標記物：金黃色葡萄球菌的A蛋白、生物素（維生素）、地高辛（小分子藥物） 原理：金黃色葡萄球菌的A蛋白與IgG的Fc有高度親和力。用酶、同位素和熒光素等標記A蛋白，與抗體結合，可用于抗原抗體反應的分析。,2024/3/11,三、免疫

11、定位分析,1.免疫熒光定位分析2.酶標記免疫定位3.免疫電子顯微鏡技術,2024/3/11,,1、免疫熒光定位分析 用不同發(fā)光顏色的熒光化合物標記抗體用于免疫細胞化學、免疫組織化學檢測。（熒光化合物+抗體）------生物大分子（抗原）在細胞或組織中的表達和定位熒光素：異硫氰熒光素、異硫氰四甲基羅丹明熒光顯微鏡觀測熒光激活細胞分揀器（流式細胞儀）應用：CD4+、CD8+T細胞亞群計數原理：流式細胞儀產生分析的電信

12、號生要是光散射信號和熒光信號，流式細胞儀依據細胞流經光照射區(qū)時電壓訊號的強弱來分析和分選細胞。,2024/3/11,,2、酶標記免疫定位 酶標記免疫定位的方法及原理與dot-ELISA相同，所用的酶底物在反應后必須形成不溶于水的有色產物。酶標記免疫定位主要用于免疫組織化學進行組織和細胞內的抗原定位，及在免疫印跡分析中代替同位素標記進行定位顯色等。,2024/3/11,,（1）酶標免疫組織化學固相抗原為組織切片或細胞樣品。（2）免

13、疫印跡 蛋白質經凝膠電泳后，形成不同的條帶，轉移至硝酸纖維膜上，用酶標記的抗體進行顯色反應，可確定目的蛋白的有無，或分子量大小。 分三個階段進行 :SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）轉移——硝酸纖維素膜 酶免疫定位,2024/3/11,,,免疫印跡法原理示意圖,2024/3/11,,3、免疫電子顯微鏡技術電子顯微鏡技術與免疫反應相結合的一項技術。優(yōu)點：提高了電鏡觀察的特異性。 如形態(tài)相同，但結構和

14、組成不同的生物粒子，細胞器或病毒粒子。種類： 一類是先用抗體捕捉抗原，然后用磷鎢酸負染色觀察。另一類是用金標記抗體進行抗原定位。膠體金與抗體Fc段結合。,2024/3/11,四、抗原抗體反應的其他應用,1、免疫親和色譜 免疫親和色譜是一種從多組分混合物中分離純化單組份產物簡便而有效的方法，比凝膠過濾和離子交換色譜或得的產物純度更高。原理：任何一對抗原-抗體的組分之一與固相基質交聯(lián)后均可用于另一組分的純化。廣泛用于蛋白質抗原的

15、分離純化。固相基質：瓊脂糖、葡聚糖,2024/3/11,,,,,,,OD280檢測,凝膠電泳,,,,,,免疫親合色譜示意圖,2024/3/11,2、免疫生物感應器與抗體芯片機理：抗原與抗體在相互結合后，它們的結構發(fā)生了變化，一些次級鍵參與結構的變化。這種結構的改變通過電場效應的改變可以被檢測到?？梢耘袛嗫乖贵w的結合是否發(fā)生及發(fā)生的強度。,,,組成：a生物受體（抗體）b轉導體 c電子放大處理器,,謝謝觀賞,免疫學導論,10生物技