雜色鮑血藍(lán)蛋白功能肽段的多樣性及AbSV感染后血漿的差異蛋白質(zhì)研究.pdf

1、鮑屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、鮑科(Haliotiidae)。鮑被稱為海產(chǎn)八珍之首,肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,是中華民族的傳統(tǒng)珍饈佳肴,此外鮑還具有很高的藥用價(jià)值。雜色鮑(Haliotis diversicolor)是我國(guó)南方重要的鮑養(yǎng)殖品種。近年來(lái)鮑養(yǎng)殖業(yè)急速膨脹,養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化,鮑病害呈現(xiàn)爆發(fā)性的增長(zhǎng)趨勢(shì),對(duì)鮑養(yǎng)殖業(yè)造成了極大損害。例如,鮑肌肉萎縮癥病毒(a

2、balone shriveling syndrome-associated virus,AbSV)從發(fā)現(xiàn)至今,每逢冬季、春季反復(fù)暴發(fā),且每次都是毀滅性的,該病毒不歸于已知病毒種類,病毒形態(tài)尚未確定,基因結(jié)構(gòu)特殊,不編碼外殼蛋白。隨著病毒等病害的增長(zhǎng),如何防治鮑病害已經(jīng)引起了相關(guān)科研人員及養(yǎng)殖業(yè)者的高度重視,而提高免疫力無(wú)疑是鮑健康養(yǎng)殖的一條最根本和行之有效的方法。然而,從分子水平上對(duì)其先天免疫系統(tǒng)以及免疫因子的研究還十分有限,客觀上限制

3、了鮑病害防控技術(shù)的發(fā)展。血藍(lán)蛋白具有多樣的免疫功能,在以完整的蛋白分子發(fā)揮免疫作用的同時(shí),還能降解成更小的肽段行使功能,本研究以雜色鮑血淋巴為材料利用雙向電泳和Western雜交對(duì)蛋白質(zhì)組和血藍(lán)蛋白(Hemocyanin)進(jìn)行研究,為深入開展鮑的分子免疫研究打下良好基礎(chǔ)。
　　本研究以鮑血淋巴為材料建立可與質(zhì)譜兼容的雙向電泳技術(shù)體系。首先,確定了以丙酮沉淀法和RC DC蛋白定量試劑盒為基礎(chǔ)的蛋白制備與定量方法;其次對(duì)樣品前處理方法

4、進(jìn)行了摸索,通過(guò)500 r/min的低速離心方法分離了血細(xì)胞和血漿組分,通過(guò)35000 r/min超速離心2 h除掉了部分高豐度的血藍(lán)蛋白,降低了高分子量區(qū)域的血藍(lán)蛋白背景;進(jìn)一步使用18 cm pH3-10非線性膠條和優(yōu)化后的電泳程序,對(duì)不同上樣量的電泳結(jié)果進(jìn)行了比較,可獲得良好的雙向電泳圖譜;最終對(duì)其中4個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定,分別為肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、膠原蛋白和血藍(lán)蛋白。鮑血淋巴雙向電泳技術(shù)的建立為后續(xù)的鮑差異及功能蛋白質(zhì)組學(xué)研

5、究提供了技術(shù)保障。
　　本研究利用雙向電泳與Western結(jié)合的方法獲得血藍(lán)蛋白大量的功能肽段。在業(yè)已建立的雙向電泳研究方法基礎(chǔ)上,本研究對(duì)雜色鮑血淋巴總蛋白進(jìn)行了雙向電泳分離,進(jìn)一步使用親和純化制備的高效價(jià)血藍(lán)蛋白多克隆抗體進(jìn)行了Western檢測(cè)(血淋巴總蛋白上樣120μg,雜交一抗比例為1:20000,二抗比例為1:20000),獲得了清晰的雜交斑點(diǎn)圖。雜交得到數(shù)十個(gè)陽(yáng)性蛋白點(diǎn),主要集中在分子量40-100 KDa、等電點(diǎn)5

6、-8。對(duì)其中的24個(gè)點(diǎn)成功的進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定,初步判斷為血藍(lán)蛋白7種不同的肽段。
　　本研究獲得AbSV感染后雜色鮑血漿總蛋白在5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、6 h、12 h、24 h及72 h)的差異表達(dá),其中前4個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)變化較為明顯的差異蛋白點(diǎn)有20個(gè),包括持續(xù)上升、先升后降、先降后升以及特殊點(diǎn),而感染72 h時(shí)差異蛋白點(diǎn)有63個(gè)。質(zhì)譜鑒定結(jié)果包括肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和膠原蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白,以及果糖酶和血藍(lán)蛋白等功能蛋白。這些信息的