鈣離子載體A23187對臍血來源EPC作用及應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片檢測蛋白質(zhì)表達(dá)差異的研究.pdf

1、研究背景：組織工程血管以及組織工程化組織的血管化因目前內(nèi)皮種子細(xì)胞擴(kuò)增能力和生物活力的不足而受到限制。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。并可被轉(zhuǎn)移至外周血，參與缺血組織的血管重建和血管的內(nèi)膜化，因此EPCs有望成為今后組織工程內(nèi)皮種子細(xì)胞的重要來源。為此，有關(guān)EPCs的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴(kuò)增和細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控亟待深入研究，在細(xì)胞行為調(diào)控中，鈣離子是細(xì)胞生物行為的重要調(diào)控

2、因子，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡時，會導(dǎo)致多種細(xì)胞異常行為發(fā)生，從而引發(fā)疾病。鈣離子載體A23187是一種高度選擇性的鈣離子載體，能與Ca2+形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使胞外的Ca2+透過細(xì)胞膜，生理性或人為性地提高胞漿游離鈣水平，有效增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，增高的Ca2+作為第二信使可促使蛋白激酶C（PKC）和其他鈣依賴性蛋白激酶活化，并催化細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)磷酸化，從而啟動淋巴細(xì)胞活化、增殖。此外，A23187還是氧化磷酸化的解偶聯(lián)體，抑制線粒體

3、ATP酶的活性，影響細(xì)胞代謝水平。
　　 研究目的第一部分研究目的在于建立體外培養(yǎng)臍血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)體系，包括臍帶血采集、單個核細(xì)胞分離、內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)、內(nèi)皮祖細(xì)胞生長特性和表型分析鑒定。第二部分研究目的在于利用移動性鈣離子載體A23187作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞，觀察其對內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用影響；以表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜（surfaceenhanced laser desorption/ionization-time

4、 of flight-massspectrometry，SELDI-TOF-MS）技術(shù)分析A23187作用后的內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化及其對細(xì)胞表型和細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，探討不同濃度A23187及引起的相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化對內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制和作用，為內(nèi)皮祖細(xì)胞調(diào)控機(jī)制和臨床應(yīng)用提供研究依據(jù)。
　　 研究方法在第一部分中，經(jīng)無菌采集后的臍帶血，在2小時內(nèi)經(jīng)密度梯度離心獲得單個核細(xì)胞，以本室已建立的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)體

5、系培養(yǎng)，從臍血獲得的單個核細(xì)胞接種4天后，分別選取貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)至第12天后，觀察兩種方法所獲得細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量。對懸浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)對培養(yǎng)7天后的細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞表型CD34、CD133、vWF、CD146，CD144鑒定，培養(yǎng)過程中，觀察細(xì)胞生長狀況并測定細(xì)胞生長曲線。在第二部分中，鈣離子載體A23187以0，1，3，5μmol/L作用于培養(yǎng)至第七天的內(nèi)皮祖細(xì)胞，作用24小時，后流式細(xì)胞

6、術(shù)檢測A23187不同濃度作用下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，并且利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度A23187作用下P1H12（CD146）的表達(dá)量。采用SELDI蛋白質(zhì)芯片檢測不同A23187濃度作用下蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況：1.Western-IP裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)提取并利用BCA法測定蛋白濃度；2.蛋白活化點樣；3.芯片檢測；4.數(shù)據(jù)處理與分析。
　　 研究結(jié)果第一部分中，經(jīng)觀察篩選，發(fā)現(xiàn)從臍血獲得的單個核細(xì)胞接種4天后，分別選取貼壁細(xì)胞和懸

7、浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)至第12天后，觀察兩種方法所獲得細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量。發(fā)現(xiàn)選取貼壁細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞總數(shù)較少為301±205，并且無梭形樣內(nèi)皮祖細(xì)胞出現(xiàn)；相反，選取懸浮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，至第12天時，細(xì)胞數(shù)量達(dá)708±142（P<0.05），并且出現(xiàn)梭形樣內(nèi)皮祖細(xì)胞。故此，本研究選用懸浮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，其接種后前5天為生長的潛伏期，細(xì)胞開始貼壁，無明顯擴(kuò)增。第6天平均每個視野下細(xì)胞數(shù)目為287±45；第9天細(xì)胞數(shù)為282±46；第12天開始，細(xì)

8、胞進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)為805±67（P<0.05，與第6天的細(xì)胞相比）；第19天細(xì)胞繼續(xù)增殖，細(xì)胞數(shù)為1115±182（P<0.05，與第6天的細(xì)胞相比）；第23天時，細(xì)胞進(jìn)入凋亡期，數(shù)量明顯減少，為265±61（P<0.05，與第6天的細(xì)胞相比）。vWF，CD146，CD144表達(dá)陽性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，梭形樣細(xì)胞群體中，CD34陽性率為88.98％±5.15％（P<0.05），CD133陽性率為1.20％±1.44％（P<0.

9、05）。第二部分中，經(jīng)SELDI技術(shù)檢測A23187不同濃度組，結(jié)果顯示共有20個差異表達(dá)蛋白，其中12個高表達(dá)，8個為低表達(dá)（P<0.05）。并且內(nèi)皮祖細(xì)胞CD146陽性率呈A23187濃度依賴性降低，并發(fā)現(xiàn)鈣離子載體A23187在濃度高至10μmol/L時，有顯著促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡作用。
　　 研究結(jié)論經(jīng)本研究建立的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)體系，能夠自臍帶血來源的單個核細(xì)胞成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出具內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)特征的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞表型鑒定為內(nèi)皮