氧化亞鐵硫桿菌遺傳多樣性及比較蛋白質組學研究.pdf

1、T.f菌(氧化亞鐵硫桿菌)是主要的浸礦細菌之一，為了探討T.f菌浸礦機理，提高生物浸出的效率，本文從T.f菌的遺傳多樣性及比較蛋白質組學等方面做了系統(tǒng)的研究。 本研究采用RAPD分子標記技術對7個不同來源的T.f菌菌株的遺傳多樣性進行了研究。首先采用正交實驗方案對影響RAPD實驗的一些影響因素如Mg2+濃度、TAQ酶的用量等進行了優(yōu)化，從而保證了RAPD反應的穩(wěn)定性和可重復性。通過T.f菌的RAPD分子標記的研究，發(fā)現來源不同的

2、T.f菌菌株之間存在較大的差異性，最大的相關系數是82.93％，最小的相關系數是44.44％。對T.f菌的氧化活性的測定也發(fā)現不同的菌株之間存在較大的差異，其中城門山T.f菌菌株活性最強，作為后面的試驗菌株。 通過測定不同培養(yǎng)條件下的T.f菌的生長曲線，揭示了分別在以單質硫、Fe2+及磷酸鹽缺失條件下T.f菌菌株的生長規(guī)律。使用pH2.0的9K基本培養(yǎng)基，在30℃條件下置培養(yǎng)箱充氣培養(yǎng)，記錄不同時間點的活菌數。研究表明，T.f菌

3、和其它細菌培養(yǎng)相似，也有靜止期、對數生長期、穩(wěn)定期和衰老期。在以Fe2+為營養(yǎng)源的培養(yǎng)條件下，氧化亞鐵硫桿菌的生長對數期為培養(yǎng)的第10～32hrs，T.f菌的最高濃度可達1×107.5cells/ml，在對數生長期，T.f菌復制一代所需的時間約為1.59hrs；磷酸鹽缺失條件培養(yǎng)的T.f菌的對數期為第20～60hrs間，T.f菌的最高濃度只有約為1×105.5cells/ml，T.f菌復制一代所需時間約為3.48hrs；在單質硫上培養(yǎng)的

4、T.f菌其對數期處于第4～12days之間，菌的濃度最高可達1×107.5cells/ml，細菌復制一代所需時間約為11.91hrs。 研究了不同營養(yǎng)源培養(yǎng)對于T.f菌浸出金屬硫化礦的影響，發(fā)現營養(yǎng)源不同，所培養(yǎng)的T.f菌浸出金屬硫化礦的活性也存在明顯差異。研究了不同濃度的甲硫氨酸、L-半胱氨酸對細菌浸出金屬硫化礦的影響，發(fā)現在一定的濃度下L-半胱氨酸能夠促進T.f菌浸出金屬硫化礦；而甲硫氨酸會抑制金屬硫化礦的生物浸出。這是由于

5、L-半胱氨酸具有一個巰基基團，能夠與金屬硫化礦發(fā)生反應生成多硫化合物，從而促使金屬硫化礦解離。研究了金屬離子Cu2+、Cd2+等對T.f菌浸出金屬硫化礦的影響，發(fā)現這兩種金屬離子都在不同程度上抑制了金屬硫化礦的細菌浸出；但在對野生T.f菌用不同金屬離子馴化后，發(fā)現在對應的金屬離子濃度下，反而會促進金屬硫化礦的細菌浸出。這些工作為后面進一步開展比較蛋白質組學的研究提供了思路并奠定了基礎。 我們對雙向電泳中的8000伏聚焦時間、干膠

6、條pH范圍的選擇、蛋白上樣量等進行了優(yōu)化。發(fā)現選用pH4-7范圍的干膠條在8000伏電壓下聚焦5hrs，并且上樣量＞400μg時，T.f菌的分離效果好，所分離的蛋白質點約為540個左右。我們也對染色的方法作了比較，發(fā)現“Silverblue”膠底考染的方法在上樣量為900μg時，也能取得較好的效果，而且考染對后面蛋白質質譜的鑒定較銀染而言有更好的兼容性。 運用蛋白質組學的方法，對磷酸鹽缺失條件培養(yǎng)的T.f菌進行了比較蛋白質組學研

7、究。首先，采用雙向電泳的方法分離蛋白，結合MALDI-TOF/MS(基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜)對分離蛋白進行鑒定。采用pH3-10的膠條與pH4-7的膠條分別進行第一向等電聚焦，12.5％SDS-PAGE進行第二向電泳，得到了分辨率和重復性較好的對照組T.f菌和磷酸鹽缺失培養(yǎng)的T.f菌總蛋白的雙向電泳圖譜，并用PDquest軟件對它們進行了圖像分析，在銀染的雙向膠上，可分辨540±15個蛋白點，發(fā)現了70多個差異蛋白質點，其中

8、21個在磷酸鹽缺失條件下是表達上調的，50個在磷酸鹽缺失培養(yǎng)條件下是表達下調的。從膠上切下10個差異表達的蛋白點，經胰蛋白酶酶解后，MALDI-TOF質譜測定結合Mascot基因組數據庫搜索，鑒定出6個差異表達蛋白質點。通過對已鑒定的蛋白進行功能分析，發(fā)現了一些與磷酸鹽缺失相關的蛋白，這包括與細胞的氧化磷酸化相關的NADH脫氫酶，與磷酸戊糖代謝相關的轉醛酶，以及含AP2域的轉錄因子等。針對雙向電泳難以分離低分子量的小蛋白(特別是10kD

9、a以下)的缺點，本論文采用三種SELDI蛋白質芯片對T.f菌表達譜的低分子量區(qū)域進行了初步的研究，并在6360.18～15659.51Da范圍內發(fā)現共有13個差異表達的小蛋白。 采用差異蛋白質組學的方法，對不同營養(yǎng)源(單質硫和Fe2+)培養(yǎng)的T.f菌的差異表達譜進行了研究。雙向電泳結果的分析表明約有80個差異蛋白出現，其中在單質硫培養(yǎng)條件下表達上調的有45個，表達下調的有36個。通過MALDI-TOF-MS和ESI-MS/MS(

10、電噴霧串連質譜)技術共鑒定出20個蛋白，其中大小為46kDa的細胞色素C和細胞色素氧化酶Ⅱ在Fe2+的氧化中起作重要的作用；有ATP合成酶的α鏈、β鏈，有雙重ATP酶域ABC載體的ATP酶成份。另外還發(fā)現差異表達的與脂肪酸代謝相關的酶：Acyl-coA脫氫酶(脂酰輔酶A脫氫酶)、Enoyl-CoA水合酶、長鏈脂肪酸－輔酶A連接酶(fadD-4)等并進行了功能上的分析。同時也采用了三種SELDI蛋白質芯片研究不同營養(yǎng)源培養(yǎng)的T.f菌差異表