中國(guó)明對(duì)蝦血藍(lán)蛋白的組織分布特點(diǎn)及白斑癥病毒感染后血藍(lán)蛋白含量的變化.pdf

1、本論文應(yīng)用抗中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)血藍(lán)蛋白單克隆抗體,研究血藍(lán)蛋白在中國(guó)明對(duì)蝦鰓、心、胃、中腸、淋巴器官、卵巢和肝胰臟等組織器官中的分布特點(diǎn);用不同濃度白斑癥病毒(WSSV)感染中國(guó)明對(duì)蝦,測(cè)定血淋巴中血藍(lán)蛋白和總蛋白含量的變化。旨在為血藍(lán)蛋白抗WSSV感染免疫作用機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。主要包括以下3部分:
　　1.抗中國(guó)明對(duì)蝦血藍(lán)蛋白單克隆抗體的特性分析及抗原抗體最佳使用稀釋度的確定

2、r>　　復(fù)蘇抗中國(guó)對(duì)蝦血藍(lán)蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2H3,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,以中國(guó)明對(duì)蝦血淋巴上清液為抗原,用Western-blotting法對(duì)單抗2H3進(jìn)行特性分析,并通過(guò)棋盤法滴定法確定酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)中抗原抗體最佳稀釋倍數(shù)。結(jié)果表明:單抗2H3可與中國(guó)對(duì)蝦血藍(lán)蛋白的分子量分別為73 kDa和75 kDa的兩個(gè)亞基發(fā)生特異性反應(yīng);ELISA中抗原抗體的最佳使用稀釋倍數(shù)分別為10-4和2-2。
　　2.中國(guó)明對(duì)

3、蝦血藍(lán)蛋白的組織分布特點(diǎn)
　　以篩選出的單抗2H3為第一抗體,采用石蠟切片、免疫組化方法,研究血藍(lán)蛋白在中國(guó)明對(duì)蝦鰓、心、胃、中腸、淋巴器官、卵巢和肝胰臟等組織器官中的分布特點(diǎn)。結(jié)果表明:血藍(lán)蛋白在各組織器官中均有分布,在鰓絲小葉邊緣的微血腔、心肌束間隙、淋巴器官的淋巴腔中以及肝小管中陽(yáng)性信號(hào)較強(qiáng):在卵巢卵母細(xì)胞之間的血竇、胃內(nèi)壁環(huán)肌層結(jié)締組織的血竇和中腸結(jié)締組織血竇中有陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)論認(rèn)為,中國(guó)明對(duì)蝦血藍(lán)蛋白陽(yáng)性信號(hào)大多來(lái)自血淋巴

4、而非實(shí)質(zhì)組織,且在血淋巴含量多、血流量大的部位含量豐富,在某些血淋巴無(wú)法到達(dá)的部位(肝小管內(nèi)壁等)也有血藍(lán)蛋白分布,血藍(lán)蛋白含量的這種組織特異性與各組織器官的功能有著密切的聯(lián)系。
　　3.白斑癥病毒感染后中國(guó)明對(duì)蝦血藍(lán)蛋白含量的變化
　　取患白斑癥的螯蝦鰓,每克鰓組織加10 ml磷酸緩沖液勻漿,離心、過(guò)濾后以濾液為病毒粗提母液,稀釋至10-2,10-4和10-6作為WSSV注射液,注射感染中國(guó)明對(duì)蝦,繪制存活率曲線。實(shí)驗(yàn)證明

5、以10-2、10-4和10-6這三個(gè)病毒稀釋度感染中國(guó)明對(duì)蝦,不僅可以保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均被成功感染上病毒,也可以保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不同時(shí)間段均有足夠的存活對(duì)蝦可供取樣。
　　分別以10-2,10-4和10-6 WSSV粗提液尾節(jié)肌肉注射感染中國(guó)明對(duì)蝦,分別在感染后0 h,6 h,12 h,24 h,36 h,48 h和72 h取樣。
　　取對(duì)蝦鰓組織,two-step PCR檢測(cè)WSSV。10-2 WSSV感染組在WSSV感染后12

6、 h于鰓中檢出病毒,10-4 WSSV感染組在感染后12 h被第二步PCR檢出病毒,10-6 WSSV感染組在感染后24 h被第二步PCR檢出病毒。
　　抽取血淋巴,ELISA測(cè)定血藍(lán)蛋白的含量。結(jié)果顯示,在10-22WSSV感染組,感染后6 h血藍(lán)蛋白含量顯著上升(A405nm=0.74±0.036,ANOVA,p＜0.05)并在12 h達(dá)到最高值(A405nm=0.77±0.047,ANOVA,p＜0.05),在24 h降至對(duì)

7、照水平,隨后持續(xù)下降并顯著低于對(duì)照組,直到72 h達(dá)到最低值(A405nm=0.18±0.046,ANOVA,p＜0.05)。在10-4和10-6WSSV感染組,血藍(lán)蛋白含量在感染后0 h,6 h,12 h和24 h無(wú)顯著變化,從36 h起顯著低于對(duì)照組,持續(xù)下降至72 h達(dá)到最低(10-4:A405nm=0.23±0.053:10-6:A405nm=0.22±0.050,ANOVA,p＜0.05)。
　　考染法測(cè)定血淋巴總蛋白的

8、含量。結(jié)果顯示,在10-2,10-4和10-6 WSSV感染組中,血淋巴總蛋白含量均在感染W(wǎng)SSV后6 h顯著高于對(duì)照組,并在12 h達(dá)到最大值(10-2:108.18±1.36 mg/ml;10-4:103.49±1.33 mg/ml;10-6:96.94±1.06 mg/ml,ANOVA,p＜0.05),在72 h顯著低于對(duì)照組(10-2:86.95±0.52 mg/ml;10-4:89.27±0.76 mg/ml;10-6:85.