中國對(duì)蝦感染白斑癥病毒(WSSV)后血細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定及其特性分析.pdf

1、病毒感染會(huì)激發(fā)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng),宿主細(xì)胞內(nèi)的一些因子在這一過程中起著重要的作用,其表達(dá)量通常會(huì)發(fā)生上調(diào)或下調(diào)的表達(dá)變化。白斑癥病毒(WSSV)病是危害對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的最重要疾病之一,中國對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)對(duì)其極其易感,為尋找在中國對(duì)蝦應(yīng)答WSSV感染反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的蛋白,本文利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定了中國對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后血細(xì)胞中發(fā)生差異表達(dá)的蛋白質(zhì),并對(duì)其中的2種蛋白—小泛素相關(guān)修飾物(SU

2、MO)和蛋白磷酸酶進(jìn)行了深入分析,為揭示對(duì)蝦抗WSSV反應(yīng)的分子機(jī)制提供了重要數(shù)據(jù),具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)中國對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后血細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定。雙向(2D)電泳分離感染組和對(duì)照組對(duì)蝦血細(xì)胞樣品,并用PDQuest軟件分析2D凝膠。結(jié)果成功獲得了中國對(duì)蝦血細(xì)胞總蛋白2D圖譜,每張凝膠上有約580個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被檢測(cè)出;WSSV感染24后,共有26個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)呈顯著性上調(diào)表達(dá)(P﹤0.05),19個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)呈顯著性

3、下調(diào)表達(dá)。隨后,對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析,共有33種蛋白質(zhì)得到了成功的鑒定,包括SUMO1、細(xì)胞質(zhì)MnSOD、微管蛋白α1鏈、微管-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)因子1、磷酸丙糖異構(gòu)酶、核受體 E75蛋白、空泡ATP合酶亞基 BL、肌醇1,4,5-三磷酸受體和精氨酸激酶等;利用生物信息學(xué)方法將鑒定的蛋白進(jìn)行GO功能分類,結(jié)果將其分為9個(gè)類群,分別為:免疫相關(guān)蛋白、刺激應(yīng)答蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白、葡萄糖代謝相關(guān)蛋白、甾類激素介導(dǎo)的信

4、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、ATP合酶、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和未分組蛋白。此外,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)WSSV感染后對(duì)蝦血細(xì)胞中3種上調(diào)表達(dá)蛋白(細(xì)胞質(zhì)MnSOD、熱休克蛋白70和精氨酸激酶)和1種下調(diào)表達(dá)蛋白(酚氧化酶原)對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)變化情況,結(jié)果顯示,這些因子在 mRNA水平的變化與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果較為一致。
　　(2)中國對(duì)蝦SUMO及其 E2結(jié)合酶UBC9的基因克隆與表達(dá)分析。從鑒定出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中選取SUMO進(jìn)行深入分析,首先,采用RA

5、CE技術(shù)對(duì)中國對(duì)蝦SUMO和UBC9進(jìn)行基因克隆,結(jié)果顯示,中國對(duì)蝦SUMO cDNA全長(zhǎng)1128 bp,包含一個(gè)282 bp的開放閱讀框(ORF),編碼93個(gè)氨基酸,其理論分子量為10.6 kDa;UBC9 cDNA全長(zhǎng)1170 bp,包含一個(gè)483 bp的ORF,編碼160個(gè)氨基酸,其理論分子量為18.4 kDa;同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),中國對(duì)蝦的SUMO和UBC9均高度保守。隨后,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)了SUMO和UBC9 mRN

6、A的組織分布情況和在 WSSV感染后的表達(dá)變化情況,結(jié)果顯示,SUMO和UBC9基因在健康中國對(duì)蝦各組織中均有表達(dá),但表達(dá)水平不同,二者均在血細(xì)胞和性腺中呈高豐度表達(dá);WSSV感染后,對(duì)蝦血細(xì)胞和性腺中這2種基因均呈顯著性上調(diào)表達(dá),且血細(xì)胞中的上調(diào)表達(dá)更為顯著。
　　(3)中國對(duì)蝦SUMO ORF和UBC9 ORF的原核表達(dá)及多克隆抗體制備及應(yīng)用。利用大腸桿菌系統(tǒng)成功地構(gòu)建了中國對(duì)蝦SUMO ORF和UBC9 ORF的重組表達(dá)質(zhì)粒

7、,pET-28a-SUMO和pET-28a-UBC9,誘導(dǎo)表達(dá)后得到分子量分別為19.7 kDa和25.6 kDa的重組蛋白,并對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化;用純化蛋白免疫小鼠,分別獲得了抗SUMO和UBC9的多克隆抗體(PAb)。應(yīng)用PAb分析中國對(duì)蝦血細(xì)胞中SUMO和UBC9的特性,western blotting結(jié)果顯示,SUMO的PAb可以特異性識(shí)別血細(xì)胞中13.5 kDa的蛋白,而UBC9的Pab可以識(shí)別18.7 kDa的蛋白;間接免

8、疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SUMO分布于血細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,而UBC9主要分布于細(xì)胞核中。
　　(4)RNA干擾實(shí)驗(yàn)分析SUMO和UBC9在病毒感染中的作用。利用體外轉(zhuǎn)錄法,分別合成了SUMO和UBC9的雙鏈RNA(dsRNA),dsSUMO和dsUBC9。隨后,將dsRNA注射到對(duì)蝦體內(nèi)以研究SUMO或UBC9基因沉默對(duì)WSSV感染的影響。結(jié)果顯示,病毒感染后,RNA干擾組對(duì)蝦血細(xì)胞中的WSSV拷貝數(shù)和病毒基因的表達(dá)量均較陽性對(duì)

9、照組低;累計(jì)死亡率曲線顯示,SUMO或UBC9的沉默均在一定程度上降低了WSSV感染引起的對(duì)蝦的死亡。
　　(5)中國對(duì)蝦蛋白磷酸酶1催化亞基β(PP1β)的基因克隆及原核表達(dá)。首先,采用RACE技術(shù)對(duì)中國對(duì)蝦PP1β進(jìn)行基因克隆和生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示,PP1βcDNA全長(zhǎng)1214 bp,包含一個(gè)987 bp的ORF,編碼328個(gè)氨基酸,其理論分子量為37.6 kDa;同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),中國對(duì)蝦的PP1β氨基酸序列表現(xiàn)出高度保守

10、性。隨后,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了PP1β mRNA的組織分布情況和在WSSV感染后的表達(dá)變化情況,結(jié)果顯示,PP1β在健康中國對(duì)蝦各組織中均有表達(dá),但表達(dá)水平不同,其中在性腺中表達(dá)最高,血細(xì)胞次之;WSSV感染后,對(duì)蝦血細(xì)胞和性腺中PP1β基因均呈上調(diào)表達(dá),并在12 h達(dá)到峰值,且血細(xì)胞中的上調(diào)表達(dá)更為顯著。此外,利用大腸桿菌系統(tǒng)成功地構(gòu)建了中國對(duì)蝦PP1βORF的重組質(zhì)粒pET-28a-PP1β,誘導(dǎo)表達(dá)后得到分子量為41 kD