浮游生物傳播對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的研究.pdf

1、本文研究的目的就是檢驗浮游生物是否可以成為對蝦白斑綜合癥的傳播媒介并研究其傳播機制。 以對蝦養(yǎng)殖池塘中常見的湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)、亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、鹽藻(Dunaliella salina)和中肋骨條藻(Skeletonema costatum)四種浮游微藻為實驗對象，在與病毒粗提液混合后0．5、1、2、4、8、12、24、48、72、

2、96、120、144、168h采樣，每個實驗三個重復(fù)，研究其對WSSV的攜帶和傳播。研究結(jié)果表明，這四種微藻和WSSV病毒粗提液混合后，經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在混合后96 h內(nèi)微藻都可以攜帶WSSV，其中湛江等鞭金藻和亞心形扁藻在144 h內(nèi)為WSSV陽性，鹽藻在120 h內(nèi)為陽性，然后在不同時間之后呈現(xiàn)WSSV陰性，這說明浮游微藻可以攜帶WSSV。 通過病毒—浮游微藻吸附法對對蝦池塘中三種常見浮游動物——壺狀臂尾輪蟲．Brachi

3、onus urceus、克氏紡錘水蚤Acartia clausi和黑褐新糠蝦Neomysisawatschensis進行了WSSV的感染實驗，實驗分對照、浸泡法和病毒—浮游微藻吸附法攻毒組三個處理，每個處理三個重復(fù)。套式PCR檢測結(jié)果表明，對照組和浸泡法攻毒組中的三種浮游動物均為病毒陰性，而病毒—浮游微藻吸附法則使WSSV成功感染這些浮游動物，攻毒組中三個重復(fù)的檢測結(jié)果均為陽性，從而找到了一種新的浮游動物感染W(wǎng)SSV的方法；同時表明，微

4、藻可以傳播WSSV。 采用病毒一浮游微藻吸附法使WSSV感染壺狀臂尾輪蟲，然后刺激其產(chǎn)生休眠卵，每個處理三個重復(fù)，套式PCR檢測結(jié)果表明，輪蟲的休眠卵和由此孵化出的幼體也為WSSV陽性，這表明，輪蟲可以通過水平和垂直兩種途徑感染上WSSV。用WSSV陽性的輪蟲投喂中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis第Ⅲ期蚤狀幼體(ZⅢ)，每個處理十個重復(fù)。實驗表明，雖然幼體沒有出現(xiàn)嚴重死亡，對照組的死亡率(34.67±15

5、.11％)和攻毒組(39.47±15.44％)差異性也不顯著(P>0.05)；但是幼體的生長和變態(tài)卻受到很大的影響，變態(tài)率(19.26士5.4％)與對照組(74.22±10.18％)相比差異顯著(P<0.01)。經(jīng)套式PCR檢測表明，攻毒組中40％的對蝦幼體為WSSV陽性，而對照組全為陰性。由此證明，輪蟲可以成為WSSV傳播中的媒介。通過套式PCR檢測發(fā)現(xiàn)，環(huán)膠州灣對蝦養(yǎng)殖池塘底泥分離出的150份橈足類休眠卵中14.67％為WSSV陽性

6、。由這些休眠卵孵化而來的幼體中6％為病毒陽性，但是，從WSSV陽性休眠卵孵化而來的幼體病毒陽性率卻高達36.37％。運用病毒一浮游微藻吸附法對橈足類的哲水蚤類Acartia sp.進行WSSV攻毒實驗，套式PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒組三個重復(fù)中的哲水蚤均為WSSV陽性，其所產(chǎn)的休眠卵以及由此孵化而來的哲水蚤幼體也為病毒陽性，而對照組中的哲水蚤成體、休眠卵和幼體均為陰性。這表明，橈足類也可以通過水平和垂直兩種途徑感染W(wǎng)SSV。 通過

7、病毒-浮游微藻吸附法使橈足類美麗猛水蚤Nitocra sp.感染上WSSV，然后用這些病毒陽性猛水蚤投喂日本囊對蝦Marsupenaeus japonicus的仔蝦，每個處理四個重復(fù)，經(jīng)過15天的投喂，攻毒組(PCO)仔蝦的感染率是100％，死亡率是52.50±5.00％，投喂WSSV陰性猛水蚤對照組(NCO)的死亡率是20.00士0.00％，兩組相比差異顯著(P<0.05)。為了確認WSSV陽性猛水蚤體內(nèi)病毒的感染性，本實驗還用病毒陽

8、性猛水蚤的組織粗提液注射日本囊對蝦稚蝦，每個處理四個重復(fù)，攻毒20天后，對蝦的死亡率是72.50±9.57％；一步.PCR檢測攻毒組的稚蝦全部為病毒陽性，而注射病毒陰性猛水蚤組織粗提液稚蝦的死亡率是22.50±5.00％，顯著低于攻毒組(P<0.05)；并且套式PCR檢測該組對蝦為陰性。本研究結(jié)果證明，猛水蚤可以作為WSSV的宿主而保持病毒的感染力，并成為病毒的傳播媒介。 利用病毒-浮游微藻吸附法使不同發(fā)育階段的鹵蟲感染W(wǎng)SSV

9、，運用RT-PCR方法，以WSSV囊膜蛋白VP28的特異引物檢測WSSV陽性的不同發(fā)育階段鹵蟲，發(fā)現(xiàn)WSSV沒有在鹵蟲體內(nèi)復(fù)制，由此推斷，鹵蟲可能只是WSSV的物理攜帶者，不是生物攜帶者或宿主。用感染W(wǎng)SSV的鹵蟲投喂實驗動物，以檢驗鹵蟲傳播WSSV的能力，同時嘗試了尋找新的實驗動物來代替對蝦仔蝦用于WSSV相關(guān)的實驗。黑褐新糠蝦Neomysis awatschensis和凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei仔蝦攝食WSS

10、V陽性的鹵蟲15天后，經(jīng)套式PCR可以檢測出均呈現(xiàn)WSSV陽性；而攝食WSSV陰性鹵蟲的實驗動物呈現(xiàn)WSSV陰性。但是，攝食鹵蟲的實驗動物死亡率沒有顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果說明，鹵蟲作為WSSV的物理攜帶者，可以通過食物途徑傳播病毒。另外，黑褐新糠蝦和凡納濱對蝦仔蝦攝食WSSV陽性中國明對蝦肉糜后，全部死亡，套式PCR結(jié)果也為陽性。由此說明黑褐新糠蝦是WSSV的一種易感動物，可以作為對蝦仔蝦的替代而用于WSSV的實驗，充當(dāng)實