對(duì)蝦白斑綜合癥病毒RNAi的抑制.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，wssv)，自1992年爆發(fā)以來(lái)，已在世界范圍內(nèi)傳播開來(lái)，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，至今仍未得到完全控制，是迄今為止危害最為嚴(yán)重的一種對(duì)蝦病毒，成為目前對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一。為了研究其致病機(jī)理，以便更有效的防治，本論文用siRNA、dsRNA和幾種免疫刺激物，注入凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)內(nèi)體，研究siRNA~IdsRN

2、A引發(fā)的RNAi作用以及非特異dsRNA可能引起的先天免疫反應(yīng)。選用WSSV核苷酸還原酶基因小亞基(ribonucleotide reductase small subunit，RR2)和囊膜蛋白VP28基因設(shè)計(jì)特異性的siRNA；選擇WSSV DNA聚合酶基因(DNA polymerase．DNApol)、核苷酸還原酶基因小亞基(RR2)、胸苷激酶基因(thymidylate kinase，TK)、衣殼蛋白VP24基因和囊膜蛋白VP2

3、8基因設(shè)計(jì)特異性的長(zhǎng)鏈dsRNA；綠色熒光蛋白基因(green fluorescence protein，GFP)，蝦酚氧化酶基因(prophenoloxidase，PO)用來(lái)設(shè)計(jì)非特異性長(zhǎng)鏈dsRNA；幾種免疫刺激物分別為poly(I：C)，poly(C：G)，polyC，CL097和ODN2006。 本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分，分別為siRNA和長(zhǎng)鏈dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾。siRNA實(shí)驗(yàn)選擇9組凡納濱對(duì)蝦分別作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，

4、實(shí)驗(yàn)組分別注射siRNA+WSSV病毒液，并于24、36 hr分別加注射一次siRNA；PBS和WSSV病毒液作為對(duì)照組。觀察對(duì)蝦死亡率并分別在12，24，36，48，72 hr采樣，進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定病毒量及半定量RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)量。長(zhǎng)鏈dsRNA介導(dǎo)RNAi試驗(yàn)選擇13組凡納濱對(duì)蝦分別作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別注射dsRNA+WSSV病毒液，免疫刺激物+WSSV病毒液，PBS和WSSV病毒液作為對(duì)照組。觀察死亡率并分

5、別在6，12，24，48，72 hr采樣，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)病毒量。 結(jié)果表明，特異性的siRNA能顯著的降低目的基因的表達(dá)量和WSSV擴(kuò)增速度，并對(duì)延緩對(duì)蝦死亡時(shí)間起到一定作用，效果隨著注射量的增加而加強(qiáng)；而非特異性的siRNA對(duì)于抗WSSV并無(wú)作用。另外，特異性dsRNA能顯著降低WSSV擴(kuò)增量并提高攻毒蝦的存活率，保護(hù)率達(dá)到50﹪～80﹪；與siRNA不同，非特異dsRNA也有保護(hù)作用，如dsRNA類似物Poly(I：