抗對(duì)蝦白斑綜合癥病毒特異性卵黃抗體的制備及其保護(hù)作用的研究.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合癥(White Spot Syndrome，WSS)是目前危害對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)最為嚴(yán)重的病害之一，在世界范圍內(nèi)己造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，但目前仍未得到有效的防治。因此，尋找一種安全、簡便、高效的防治方法，已成為解決該病害的關(guān)鍵。 卵黃免疫球蛋白(Eggyolk immunoglobulin，IgY)可用于治療由細(xì)菌或病毒等多種病原體引起的人類及動(dòng)物疾病，具有安全無殘留、不產(chǎn)生抗藥性、方便易得、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，特別是可以應(yīng)對(duì)復(fù)雜

2、的水體環(huán)境，針對(duì)性地使無脊椎動(dòng)物獲得被動(dòng)免疫保護(hù)，在防治一些水產(chǎn)動(dòng)物疾病方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究對(duì)WSSV進(jìn)行了擴(kuò)增、分離、鑒定，以其DNA為模板，利用PCR技術(shù)分別釣取WSSV的主要致病蛋白基因VP28、VP19、VP15，并設(shè)計(jì)兩條連接肽GGDAGD和GNSPNA，通過重疊延伸PCR技術(shù)將三段基因串聯(lián)構(gòu)成融合基因。將這些目的基因與真核表達(dá)載體pCI連接構(gòu)建單一基因重組質(zhì)粒pCI-28、pCI-19、pCI-15以及

3、融合基因重組質(zhì)粒pCI-28-19-15。通過原核細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)和轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞使其表達(dá)目的蛋白，運(yùn)用Western Blotting及間接免疫熒光反應(yīng)檢測DNA疫苗的免疫原性。結(jié)果表明，目的基因能夠進(jìn)行表達(dá)，并能夠特異性的識(shí)別WSSV抗體。從而，證明了WSSV的DNA疫苗具有良好的免疫原性，可以表達(dá)出目的蛋白并對(duì)相應(yīng)的抗體進(jìn)行識(shí)別，為其作為抗原免疫蛋雞奠定基礎(chǔ)。 以WSSV病毒滅活疫苗為對(duì)照，將上述制備的DNA疫苗作為抗原，胞

4、嘧啶-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的寡核苷酸鏈(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODNs)作為DNA疫苗佐劑免疫蛋雞，獲取抗WSSV特異性卵黃抗體。通過間接ELISA法監(jiān)測抗體活性，結(jié)果表明，CpG佐劑能夠顯著增強(qiáng)DNA疫苗的免疫性能(P<0.05)；以不同的抗原免疫蛋雞均可獲得特異性卵黃抗體，特異性IgY在110天仍保持較高的抗體活性；滅活疫苗組及DNA疫苗組的抗體活性與陰性對(duì)照組均有顯著差異(P<0.05)。

5、融合基因DNA疫苗與單一基因DNA疫苗免疫產(chǎn)生的特異性IgY活性之間無顯著差異；單一基因DNA疫苗免疫效果與其混合交叉免疫的效果也無顯著差異； 采用水稀釋，兩步鹽析，超濾法從卵黃中分離純化IgY，平均每枚蛋黃可以獲得120mg以上的IgY，特異性IgY含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)可以反映出抗體活性的變化。不同疫苗的抗體產(chǎn)物的總IgY含量基本一致；而特異性IgY含量則不同，DNA疫苗獲得的抗體產(chǎn)物中特異性IgY含量明顯高于對(duì)照，低于滅活疫苗

6、。 使用制備的IgY蛋白粉和卵黃粉，通過注射、口服、浸泡等方式系統(tǒng)地考察了抗WSSV的特異性卵黃抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被動(dòng)免疫保護(hù)效果。體外中和注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，特異性IgY能夠一定程度上抑制WSSV；在口服被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)中，1％滅活疫苗IgY蛋白粉的保護(hù)效果最佳，累計(jì)死亡率53.3％，口服10％滅活疫苗卵黃粉的保護(hù)效果其次，累計(jì)死亡率為66.7％；浸泡被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)中，滅活疫苗IgY浸泡組的死亡率為33.3％，DNA疫苗IgY浸泡處理組累