雜色鮑血藍(lán)蛋白的分離純化及其理化性質(zhì)的研究.pdf

1、血藍(lán)蛋白（hemocyanins，Hcs）是節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物體內(nèi)負(fù)責(zé)儲(chǔ)存和運(yùn)輸氧氣的大分子銅蛋白，它直接溶于血淋巴中，隨著血淋巴的循環(huán)為身體各組織提供氧氣。Hcs在結(jié)合氧的條件下為藍(lán)色，脫氧時(shí)為無(wú)色。雖然Hc跟酚氧化酶在體內(nèi)的功能不同，但是它們都屬于type-3型蛋白，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物的Hcs也能表現(xiàn)出酚氧化酶活性；一些物種的Hcs還存在細(xì)胞和細(xì)菌凝集活性，部分Hcs及其降解肽段還具有抗菌、抗病毒的功能。軟體動(dòng)物Hcs是

2、自然界最大的呼吸蛋白，研究表明它除了具有儲(chǔ)存和運(yùn)輸氧氣的功能以外，在生物進(jìn)化、寄生蟲(chóng)檢測(cè)以及抗腫瘤等研究領(lǐng)域也得到應(yīng)用。國(guó)內(nèi)對(duì)于節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白的研究較多，而對(duì)軟體動(dòng)物血藍(lán)蛋白的研究甚少。
　　 本文以雜色鮑為材料，利用超速離心和CsCl梯度離心的方法，從雜色鮑血淋巴中分離純化Hcs，SDS-PAGE檢測(cè)提取的Hcs由一種亞基構(gòu)成，分子量約為400kD；Native-PAGE電泳檢測(cè)2個(gè)異構(gòu)體（Isoforms）別為HdH1和H

3、dH2；透射電鏡下其四級(jí)結(jié)構(gòu)為圓柱體，以多十聚體、二十聚體和少量的十聚體存在血淋巴中。紫外吸收光譜法測(cè)定雜色鮑Hcs在280nm和340nm處存在吸收峰值。雜色鮑Hc在以鄰苯二酚為底物的條件下表現(xiàn)出微弱的酚氧化酶活性（Km=25.66mmol/L），一定濃度的胰蛋白酶、SDS和尿素都能使其酚氧化酶活性獲得不同程度的增強(qiáng)；以左旋多巴（L-DOPA）為底物則不表現(xiàn)出酚氧化酶活性，說(shuō)明雜色鮑Hcs發(fā)揮HdPO酶活性很有可能是一種兒茶酚酶類(lèi)型的

4、酚氧化酶（PO）。以鄰苯二酚為特異性底物研究雜色鮑Hc的酚氧化酶活性，研究表明，血藍(lán)蛋白酚氧化酶活性最適溫度34℃、最適pH 6.4；銅離子（Cu2+）能極其顯著增強(qiáng)血藍(lán)蛋白的酚氧化酶活性，增強(qiáng)率為264％，而乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、鎂離子（Mg2+）和鋅離子（Zn2+）則能極其顯著地抑制它的活性，EDTA的抑制效率最高，抑制率為52.8％，Mg2+和Zn2+的抑制率分別為27.8％和25％。鈣離子（Ca2+）對(duì)Hc酚氧化酶活性影

5、響不顯著。
　　 半定量RT-PCR結(jié)果顯示，腹足和外套膜是血藍(lán)蛋白在雜色鮑體內(nèi)合成的主要部位。以哈維氏弧菌感染正常雜色鮑，檢測(cè)1h、3h、6h、12h、24h血藍(lán)蛋白基因在腹足和外套膜上表達(dá)的變化情況，發(fā)現(xiàn)腹足和外套血藍(lán)蛋白基因的表達(dá)在感染哈維氏弧菌后先微弱升高，后顯著降低，推測(cè)其可能跟免疫相關(guān)。
　　 對(duì)雜色鮑Hcs理化性質(zhì)的研究，加深了對(duì)Hcs在軟體動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)中作用的認(rèn)識(shí)，具有一定的科學(xué)意義，為貝類(lèi)健康養(yǎng)