血藍(lán)蛋白的細(xì)菌凝集活性研究.pdf

1、I摘要海洋微生物酶的開發(fā)和利用是實(shí)現(xiàn)海洋資源高值化的關(guān)鍵技術(shù)之一。瓊膠酶（agarase）是可以將瓊膠（瓊脂）降解為瓊膠寡糖的酶。不同聚合度的瓊膠寡糖已被發(fā)現(xiàn)具有越來越多的生理功能活性，生產(chǎn)系列瓊膠寡糖也成為了瓊膠酶的一個(gè)主要應(yīng)用。此外，瓊膠酶還可以用于瓊脂糖電泳中的核酸回收、制備海藻細(xì)胞原生質(zhì)體、篩選信號(hào)肽序列等。目前的瓊膠酶主要來自海洋細(xì)菌。本論文首先采集汕頭海域表層沉積物和富含瓊膠的紫菜藻體樣品，從中篩選得到兩株高產(chǎn)瓊膠酶的海洋細(xì)

2、菌HZ105和ZC1。通過對(duì)菌株的常規(guī)特性分析和分類鑒定，菌株HZ105歸屬于Agarivans，命名為Agarivanssp.HZ105。而16SrDNA序列分析結(jié)果，同時(shí)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、全細(xì)胞脂肪酸組分、碳源利用、部分生理生化性質(zhì)、基因組GC含量等分析表明，菌株ZC1應(yīng)作為標(biāo)準(zhǔn)菌株建立一個(gè)新屬，其中菌株ZC1是一株代表新種的菌株。進(jìn)一步研究了培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基pH和NaCl濃度對(duì)兩菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)瓊膠酶的影響。其中菌株HZ105在pH710

3、、NaCl濃度為13％范圍內(nèi)培養(yǎng)16h產(chǎn)瓊膠酶最好，說明菌株HZ105偏好堿性環(huán)境生長(zhǎng)，其所產(chǎn)瓊膠酶也可能耐堿性。此外，菌株HZ105的胞外瓊膠酶粗酶液在室溫存放2天后還能保持90.9％的酶活力。而菌株ZC1在pH78、NaCl濃度為23％范圍內(nèi)產(chǎn)瓊膠酶最好；但ZC1的營(yíng)養(yǎng)需求比較特別，只能利用Biolog系統(tǒng)的GN2板95種碳源中葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、淀粉、糊精等少數(shù)碳源。不過菌株ZC1的瓊膠酶不是只由瓊脂誘導(dǎo)產(chǎn)生，這也是其獨(dú)特之處

4、，使運(yùn)用廉價(jià)的碳源生產(chǎn)瓊膠酶成為可能。采用從聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠回收蛋白的方法分離純化了菌株HZ105的三個(gè)胞外瓊膠酶，并通過SDSPAGE電泳測(cè)得了其分子量54kDa、58kDa、105kDa，接著運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定了該三個(gè)瓊膠酶，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)酶均為β瓊膠酶，屬于糖基水解酶50家族。根據(jù)瓊膠酶的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果和Genbank中已報(bào)道的相關(guān)瓊膠酶基因信息，設(shè)計(jì)引物，通過PCR技術(shù)從菌株HZ105中克隆了一段分子量約為105kDa的瓊膠酶

5、的編碼基因，成熟蛋白編碼序列長(zhǎng)2931bp，將該基因序列比對(duì)NCBI的CDD保守區(qū)數(shù)據(jù)庫，未搜索到保守區(qū)，說明其可能存在新的活性催化部位。將該基因與pET32a()構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，初步探索了瓊膠酶基因的重組表達(dá)。關(guān)鍵詞：菌株鑒定；瓊膠酶；分離純化；基因克??；重組表達(dá)；串聯(lián)質(zhì)譜IIImatchedthreeβagarasesbelongedtoglycosylhydrolasefamily50bytheanalysisof

6、temmassspectrometry.Basedontheresultoftemmassspectrometrythegeneofthe105kDaextracellularagaraseofstrainHZ105wasclonedusingPCRmethodthecodingsequenceofwhichwas2931bp.AftersubmittingthisgenesequencetotheCDDdatabaseonthewen

7、siteofNCBInoconserveddomainwasfoundwhichsuggestedthepresenceofanewcatalyticdomain.TheexpressionofthisgenewasstudiedinE.colistrainusingvectpET32a()ftheconstructionofrecombinant.Keywds:identificationagarasepurificationclon