大豆β-伴大豆球蛋白α亞基基因轉(zhuǎn)化大豆初步研究.pdf

1、RNA干涉(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引起的特異性序列的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。大豆種子的儲(chǔ)藏蛋白基因的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上。提高11S球蛋白的含量或降低7S球蛋白的含量可改善大豆蛋白的功能特征和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，卻不會(huì)改變總蛋白質(zhì)和脂肪的含量。因此，本實(shí)驗(yàn)以β-伴大豆球蛋白α亞基基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)RNA干擾載體，并將其轉(zhuǎn)化大豆，探究此基因?qū)μ岣叻N子中含硫氨基酸的貢獻(xiàn)，推測(cè)大豆11S與7S

2、的調(diào)控機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該基因進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究:
　　首先，根據(jù)大豆β-伴大豆球蛋白α亞基基因序列(GenBank No.AB 051865)同大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果，初步認(rèn)定，該基因在大豆基因組中具有兩個(gè)拷貝，這兩個(gè)拷貝都位于第20號(hào)染色體上，分別對(duì)應(yīng)Glyma20g28650和Glyma20g28660。這兩個(gè)拷貝在編碼區(qū)上都包含6個(gè)外顯子與5個(gè)內(nèi)含子，ORF完全相同，且都編碼605個(gè)氨基酸。用7Sα基因編碼的氨基酸序

3、列與同源基因繪制的進(jìn)化樹(shù)表明，與苜蓿(Mt)的親源關(guān)系最近，與毛果楊(Pt)的親源關(guān)系最遠(yuǎn)。在7Sα基因表達(dá)形成的蛋白質(zhì)的N端檢測(cè)到跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。
　　根據(jù)Gm7Sα基因的特點(diǎn)，借助Gateway方法，構(gòu)建了該基因的干擾載體(簡(jiǎn)寫(xiě)為pBI-Gm7SαRi)。在對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化體系中滅菌時(shí)間，標(biāo)記基因的篩選壓進(jìn)行優(yōu)化后，用構(gòu)建好的干擾載體對(duì)組培性狀良好的大豆品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。最終獲得了71株轉(zhuǎn)化苗，T0代收獲種子

4、161粒，播種于大田后，由于鳥(niǎo)害等的影響，成活65株。除對(duì)轉(zhuǎn)化苗的表型進(jìn)行觀察外，還做了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，即對(duì)T1代進(jìn)行除草劑涂抹實(shí)驗(yàn)，葉片的PCR檢測(cè)以及熒光定量確定拷貝數(shù)等多種方法對(duì)轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行檢測(cè)后，確定了20株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，其中南農(nóng)88-1有13株，Jack有7株。
　　高代RNAi-Gm7Sα轉(zhuǎn)基因植株采用系譜法對(duì)后代進(jìn)行選擇。選擇優(yōu)良單株，收獲種子后點(diǎn)播成行。分別對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行分子檢測(cè)和氨基酸含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Gm7Sα