大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引發(fā)Balb-c小鼠過(guò)敏反應(yīng)及其機(jī)理的研究.pdf

1、食物過(guò)敏被視為一種嚴(yán)重的公共營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生問(wèn)題，引起了全球廣泛的關(guān)注。大豆是人類(lèi)和動(dòng)物主要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一，但大豆同時(shí)也是聯(lián)合國(guó)規(guī)定的8類(lèi)主要致過(guò)敏食物之一。近年來(lái)研究顯示，大豆中的致敏因子極大地影響了幼年動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的有效吸收，而且可以引起人和幼年動(dòng)物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，因而限制了大豆及其制品在食品和飼料工業(yè)中的應(yīng)用。
　　 本研究針對(duì)常見(jiàn)的大豆蛋白中的主要過(guò)敏成分：大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin，運(yùn)用易致敏的Ba

2、lb/c小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，在不使用免疫佐劑的條件下，通過(guò)連續(xù)5周的灌胃方式建立過(guò)敏試驗(yàn)動(dòng)物模型，系統(tǒng)研究glycinin和β-conglycinin誘導(dǎo)Balb/c速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)理，并從粘膜免疫角度探討glycinin和β-conglycinin引發(fā)Balb/c小鼠粘膜變態(tài)反應(yīng)的機(jī)理，從而為進(jìn)一步研究glycinin和β-conglycinin的過(guò)敏機(jī)理以及預(yù)防大豆球蛋白過(guò)敏的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。
　　 1.大豆球蛋白glyc

3、inin和β-conglycinin的提取、分離和純化
　　 從脫脂大豆中提取、分離和純化出大豆球蛋白glcyinin和β-conglycinin。采用免疫法提純大豆粗蛋白，利用硫酸銨沉淀進(jìn)行分級(jí)鹽析除去大豆中的清蛋白，經(jīng)Sephrose CL-6B層析進(jìn)一步純化。結(jié)果顯示，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，glycinin和β-glycinin的純度達(dá)到95％以上。
　　 2.建立大豆球蛋白glycinin和β-conglyci

4、nin口服致敏Balb/c小鼠動(dòng)物模型
　　 運(yùn)用易致敏的Balb/c小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，在不存在免疫佐劑的條件下，通過(guò)連續(xù)5周分別灌胃lmg/ml的glycinin和β-conglycinin建立過(guò)敏試驗(yàn)動(dòng)物模型。采用被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)來(lái)測(cè)定小鼠血清中IgE和抗體反應(yīng)；熒光測(cè)定法測(cè)定腸道組織胺的含量：光鏡檢測(cè)上皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。結(jié)果表明，大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin顯著增加了血清中IgE和IgG1

5、的抗體含量以及小腸組胺的含量。肥大細(xì)胞的完整率在灌胃28d時(shí)降到最低，glycinin組肥大細(xì)胞完整率較對(duì)照組降低了66％，β-conglycinin組較對(duì)照組降低了65.7％；同時(shí)肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象嚴(yán)重，腸道上皮細(xì)胞損壞嚴(yán)重，且血壓在灌胃大豆球蛋白后3h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，與對(duì)照組相比，glycinin組小鼠血壓降低了17.6％，β-conglycinin組降低了20.8％。以上結(jié)果顯示，灌胃大豆球蛋白能夠誘導(dǎo)Balb/c小鼠的過(guò)敏反應(yīng)，同

6、時(shí)表明Balb/c小鼠是檢測(cè)大豆球蛋白過(guò)敏性的一個(gè)合適的試驗(yàn)動(dòng)物。3.大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引發(fā)小鼠速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)機(jī)理的研究
　　 在明確glycinin和β-conglycinin能夠引發(fā)Balb/e小鼠過(guò)敏反應(yīng)的基礎(chǔ)上探討其誘導(dǎo)小鼠速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理。分別用O、0.1mg/ml、lmg/ml和10mg/ml的大豆球蛋白灌胃Balb/c小鼠。ELISA法測(cè)定小鼠血清中IgE、IgG、I

7、gG1和IgG2a的抗體水平和脾臟細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的含量；MTT法測(cè)定脾臟淋巴細(xì)胞增殖情況；Annexin V-FITC法來(lái)檢測(cè)脾細(xì)胞凋亡；熒光定量RT-PCR法檢測(cè)脾臟胞中IL-4、IL-10和IFN-γ mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明，0.1mg/ml和lmg/ml的glcyinin與β-conglycinin組小鼠的抗體水平均顯著高于對(duì)照組（P<0.01），且在28d時(shí)各抗體水平均達(dá)到最高。與對(duì)照組相比，灌胃0.1mg/ml和Im

8、g/ml glycinin組和β-conglycinir組的小鼠脾細(xì)胞上清液均產(chǎn)生較高水平的IL-4、IL-5和IFN-γ(P<0.01)。灌胃lmg/ml的glycinin和β-conglycinin的小鼠脾細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ mRNA表達(dá)量顯著增加，與對(duì)照組相比，glycinin和β-conglycinin組的IL-4mRNA分別提高了1.5倍和1.8倍，IFN-γ mRNA分別提高了1.5和1.7倍，同時(shí)IL-10

9、比對(duì)照組分別降低了0.6倍和0.7倍。研究表明，0.1mg/ml和lmg/ml的大豆球蛋白容易引發(fā)小鼠的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)，尤其是lmg/ml的大豆球蛋白引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)更為嚴(yán)重。
　　 4.大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引發(fā)小鼠腸道粘膜變態(tài)反應(yīng)機(jī)理的研究
　　 探討了大豆球蛋白造成小鼠口服耐受失敗而引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)與腸道粘膜免疫之間的調(diào)控關(guān)系。免疫組化法測(cè)定小鼠小腸絨毛CD3+、CD4+和CD8+T淋巴

10、細(xì)胞的數(shù)量及固有層IgA+漿細(xì)胞的數(shù)量；TUNEL法測(cè)定小腸上皮細(xì)胞的凋亡率；熒光定量RT-PCR檢測(cè)小腸組織中IL-4、IFN-γ、IL-10和TGFβ1 mRNA的表達(dá)量；雙抗夾心法測(cè)定小腸液中slgA的含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，灌胃glycinin的小鼠腸絨毛固有層淋巴細(xì)胞(LPL) CD3+和CD4+數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，灌胃β-conglycinin的小鼠小腸CD3+和CD8+ LPL的數(shù)量（P<0.05）以

11、及CD4+LPL的數(shù)量（P<0.01）顯著高于對(duì)照組；同時(shí)固有層中整合素α4β7的數(shù)量均顯著高于對(duì)照組：灌胃glycinin的小鼠小腸上皮淋巴細(xì)胞(IEL)中CD3+、CD4+數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），整合素α4β7的數(shù)量也顯著高于對(duì)照組（P<0.01），灌胃β-conglycinin的小鼠小腸中CD3+、CD4+、CD8+IEL數(shù)量及整合素α4β7的數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.Ol)，CD4+/CD8+IEL比值也顯著高于對(duì)

12、照組(P<0.05)；顯微鏡下觀察顯示試驗(yàn)組小鼠小腸出現(xiàn)連續(xù)性陽(yáng)性染色，固有層中可見(jiàn)大量漿細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，多見(jiàn)陽(yáng)性染色的淋巴細(xì)胞：且腸組織中IL-4和IFN-γ mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著增加(P＜0.01)，而IL-10和TGFβ1 mRNA表達(dá)量顯著降低：IgA免疫組化結(jié)果顯示，灌胃glycinin和β-conglycinin組小鼠小腸固有層lgA+漿細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)性染色，說(shuō)明腸道炎癥較高。上述結(jié)果表明大豆球蛋