伴大豆球蛋白水解肽對小鼠抗大腸桿菌感染和腸道微生物區(qū)系的影響.pdf

1、大豆種子中貯藏有豐富的蛋白質，其中絕大部分是球蛋白，主要包括大豆球蛋白(Glycinin)和伴大豆球蛋白(conglycinin)。有研究表明，伴大豆球蛋白水解肽具有特殊的生理活性，能夠降低血壓，提高免疫力，抗氧化等作用。本實驗室的工作已經(jīng)證明伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽對人和動物胃腸道優(yōu)勢菌群——雙歧桿菌具有促生長作用。目前有學者報道有的蛋白水解物(如酪蛋白水解物)對有害細菌有明顯的抗菌作用。伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽是否也具有抗有害細

2、菌的作用，目前未見有報道。本研究通過體外實驗，觀察伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽對病原性大腸桿菌生長的影響；通過動物實驗探討了水解肽對動物抗大腸桿菌感染的作用；利用PCR-DGGE研究了水解肽對動物胃腸道微生物區(qū)系的影響。1.伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽對大腸桿菌生長的影響伴大豆球蛋白是大豆儲藏蛋白的一種，有關實驗研究表明其水解產(chǎn)物具有多種生理功能。本實驗旨在探討伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽對E.coLiO<,138>生長的作用。實驗中選用普通

3、肉湯和M<,9>兩種培養(yǎng)基，伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽和鹽酸徹底水解伴大豆球蛋白液，利用96孔細胞培養(yǎng)板兩倍稀釋法，進行E.coLiO<,138>培養(yǎng)實驗。實驗結果顯示當伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽含氮量大于520ug/m1時，對E.coLiO<,138>生長有抑制作用。 2.伴大豆球蛋白水解肽對小鼠抗大腸桿菌感染的作用 本實驗研究伴大豆球蛋白水解肽對小鼠抗大腸桿菌感染的作用。首先確定E.coLi O<,138>半數(shù)致死劑量。選用2

4、1日齡昆明系清潔級雄性小鼠，隨機分為5個處理組，飼喂基礎日糧3d后，將E.coLiO<,138>(菌濃為2×10<,11>CFU/L)依次10倍稀釋，分別灌喂5個處理組，每組0.2mL／只，計算灌菌56h后，其LD<,50>值為4.73×10<'10>CFU／L。免疫學指標測定：分兩批選用21日齡昆明系清潔級雄性小鼠，隨機分為6個處理組：NOR組(正常對照組)：FEC組(灌菌對照組)：基礎日糧+生理鹽水；HCL-FHC組：基礎8瓣鹽酸徹

5、底水解伴大豆球蛋白液；Conglycinin組：基礎日糧+伴大豆蛋白；PTC組：基礎日糧+伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽：P2-PTC組：基礎日糧+水解肽提純B組分；除NOR組和FEC組外，各處理組灌喂液體的總合氮量相等(3g／L)，0.2mL／只。連續(xù)灌喂21 d后，第22天中午將E.coli O<,138>(第1批菌濃為2×10<'9>CFU／L—0.042LD<,50>第2批菌濃為2×10<'11>CFU／L—4.2LD<,50>)分

6、別灌喂FEC至P2-PTC組，0.2mL／只。觀察小鼠發(fā)病及死亡情況直至灌菌后48h，處死各組小鼠，取血、脾臟和整段小腸，用放射免疫分析(RIA)法測定免疫學指標。結果顯示：小鼠灌喂伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽后，對感染不同劑量E.coli，反應不同。伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽能顯著提高灌喂2×10<'9>CFU／L E.coli O<,138>后小鼠脾臟IL-2水平(P2-PTC組19.2±9.6μg／g vs NOR組11.5±4.7

7、μg／g，p<0.05；P2-PTC組19.2±9.6μg／g vs FEC組9.4±3.7μg／g，p<0.01)，能提高腸黏膜sIgA水平；顯著降低脾臟IL-6(P2-PTC組127.1±52.8 ng/g vs NOR組276.4±60.1ng／g，p<0.01；P2-PTC組127.1±52.8 ng／g vs FEC組224.5±38.9 ng／g，p<0.05)和TNF-α(PTC組9.1±2.0μg／g vs NOR組16

8、.3±3.91μg／g，p<0.05)水平；但對血清IL-2水平無顯著性影響；顯著提高灌喂2×10<'11>CFU／L E.coli O<,138>后小鼠脾臟IL-6水平(P2-PTC組480.5±184.7 ng／g vs NOR組206.7±72.3 ng／g，p<0.05)，極顯著提高脾臟TNF-α水平(P2-PTC組43.3±5.8μg／g vs NOR組10.5±4.1μg／g，P<0.01；P2-PTC組43.3±5.8μg

9、／g vs FEC組19.7±9.0μg／g，p<0.01)；降低血清IL-6，TNF-α水平(P2-PTC組2.8±1.0μg／L vs FEC組4.6±2.0gg／L，p<0.05)。本實驗結果表明伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽能提高動物機體免疫機能，抵御外源性大腸桿菌的侵襲感染，預防胃腸道疾病的發(fā)生。3．服用伴大豆球蛋白水解肽對小鼠灌喂大腸桿菌后腸道微生物區(qū) 系和健康的影響 本實驗研究服用伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽的小鼠，灌

10、喂E.coli(2×10<'11>CFU／L)后的健康狀況，分析小鼠灌喂E.coli后24h，48h糞樣微生物區(qū)系的變化。應用PCR-DGGE技術對小鼠糞樣微生物區(qū)系進行相似性分析；應用連續(xù)稀釋PCR的方法檢測小鼠灌喂E.coli后24h，48h糞樣中細菌的數(shù)量；同時觀察小鼠灌喂E.coli后的健康狀況。實驗結果顯示小鼠灌喂E.coli后24h，鹽酸徹底水解伴大豆球蛋白液組(HCL-FHC)和灌菌對照組(FEC)的相似性較高(71.5％

11、)，伴大豆球蛋白組(Conglycinin)和伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽組(PTC)與正常對照組(NOR)的相似性都較高(分別為82.4％和72.9％)；灌喂E.coli后48h，NOR組和FEC組的相似性不高(59.6％)，PTC組和NOR組的相似性較高(73.7％)，PTC組和Conglycinin組、HCL-FHC組、FEC組的相似性都不高(分別為51.4％、56.3％、48.1％)，PTC組小鼠糞中細菌的數(shù)量明顯低于FEC組和H