碳青霉烯不敏感大腸桿菌分子特征及NDM-1適應(yīng)性代價(jià)研究.pdf

1、碳青霉烯類抗生素是在人醫(yī)臨床上能夠有效治療由攜帶超廣譜β內(nèi)酰胺酶或頭孢西丁酶腸桿菌引起的嚴(yán)重感染的最重要的藥物之一，但是，隨著碳青霉烯類抗生素在人醫(yī)臨床上的應(yīng)用不斷增加，碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌也呈現(xiàn)出不斷增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。腸桿菌產(chǎn)生對(duì)碳青霉烯抗生素的耐藥主要原因就是獲得外源性的碳青霉烯酶，其中KPC型和NDM型碳青霉烯酶是目前流行最廣的兩種。大腸桿菌是人醫(yī)臨床和獸醫(yī)臨床上最常見(jiàn)的腸桿菌之一，也是條件性致病菌和體內(nèi)共生菌，其所帶來(lái)的危害是十

2、分嚴(yán)重的，近年來(lái)碳青霉烯耐藥大腸桿菌在人醫(yī)臨床上的報(bào)道有逐年增加的趨勢(shì)。目前對(duì)于碳青霉烯耐藥大腸桿菌的研究多集中在人醫(yī)臨床上，對(duì)動(dòng)物源和環(huán)境源大腸桿菌碳青霉烯耐藥流行病學(xué)調(diào)查缺乏研究資料。適應(yīng)性代價(jià)是指細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境條件變化而做出的改變，耐藥性的持續(xù)和擴(kuò)散與適應(yīng)性代價(jià)有關(guān)，多數(shù)研究表明細(xì)菌獲得耐藥性后，與敏感菌相比其生長(zhǎng)力、毒力、穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化，這種變化決定了其能否在宿主體內(nèi)或體外環(huán)境中長(zhǎng)久存在。本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離自豬源和水源碳青霉烯類抗生

3、素不敏感大腸桿菌進(jìn)行耐藥分子特征的研究，并研究了blaNDM-1基因在大腸桿菌內(nèi)的適應(yīng)性代價(jià)。
　　本實(shí)驗(yàn)收集了2009年至2014年分離自黑龍江不同地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)的豬源大腸桿菌488株和2013年至2014年分離自哈爾濱市馬家溝河水源大腸桿菌105株，運(yùn)用微量肉湯稀釋法測(cè)定了593株大腸桿菌對(duì)22種抗菌藥物的MIC值。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，豬源和水源大腸桿菌的耐藥性都比較嚴(yán)重，多重耐藥菌普遍存在，其中對(duì)阿莫西林、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的

4、耐藥率都超過(guò)了90％，兩種來(lái)源大腸桿菌除了在對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、多粘菌素和替加環(huán)素的耐藥率有顯著性差異外，對(duì)其他抗生素耐藥率沒(méi)有顯著性差異。通過(guò)MIC值篩選出對(duì)碳青霉烯類抗生素厄他培南、亞胺培南和美羅培南不敏感大腸桿菌40株，其中豬源大腸桿菌22株，水源大腸桿菌18株，水源大腸桿菌對(duì)厄他培南、亞胺培南和美羅培南三種碳青霉烯類抗生

5、素的MIC50值和MIC90值都大于豬源大腸桿菌，說(shuō)明水源大腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性比豬源大腸桿菌嚴(yán)重。
　　運(yùn)用改良Hodge試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)，對(duì)40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌進(jìn)行表型篩選，結(jié)果顯示12株大腸桿菌改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，5株大腸桿菌EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽(yáng)性，說(shuō)明12株菌為疑似產(chǎn)碳青霉烯酶菌，5株菌為產(chǎn)金屬酶菌。
　　PCR方法擴(kuò)增40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中有可能存在的碳青霉烯酶基因（blaBIC

6、、blaKPC、 blaIMP、blaVIM、blaNDM、blaGIM、blaSPM、blaSIM、blaAIM、blaDIM、blaOXA-48）、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因（blaTEM、blaSHV、 blaCTX-M、 blaCTX-M-1組、blaCTX-M-2-組、 blaCTX-M-8組、blaCTX-M-9-組、blaCTX-M-25-組、 blaOXA）、AmpC酶基因（blaMOX、 blaCMY、blaDHA、bla

7、ACC、blaEBC、blaFOX）、質(zhì)粒介導(dǎo)的16SrRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE和npmA）和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxAB、aac(6')-Ib-cr）。結(jié)果顯示，40株大腸桿菌中，5株菌中檢出blaKPC基因，5株菌中檢出blaNDM基因，經(jīng)過(guò)測(cè)序確定了兩種基因的亞型分別為blaKPC-2和blaNDM-1，其他類

8、型的碳青霉烯酶基因沒(méi)有檢出;40株碳青霉烯酶不敏感大腸桿菌中全部擴(kuò)增出了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，其中以blaCTX-M基因的檢出率為最高，檢出率為95％(38/40)，共檢出12種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分別為blaTEM-52、blaSHV-11、blaSHV-12、blaCTX-M-3、blaCTX-M-15、blaCTX-M-55、 blaCTX-M-4、blaCTX-M-14、blaCTX-M-27、blaCTX-M-65、 bl

9、aCTX-M-125和blaOXA-1基因，其中blaTEM-52基因是首次在豬源大腸桿菌中檢出;11株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中檢出了AmpC酶基因，并且擴(kuò)增出的都是blaCMY基因，其他五種AmpC酶基因沒(méi)有擴(kuò)增到，經(jīng)過(guò)測(cè)序得到了兩種基因亞型分別為blaCMY-2和blaCMY-30;40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中16株檢出質(zhì)粒介導(dǎo)的16SrRNA甲基化酶基因，其中9株檢出armA基因，7株檢出rmtB基因;40株碳青霉烯不敏感大腸桿

10、菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因的檢出率為82.5％(33/40)，其中oqxAB、qnrS、aac(6')-Ib-cr、qepA基因的檢出率分別為55％(22/40)、40％(16/40)、37.5％(15/40)和22.5％(9/40)。
　　運(yùn)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型、多位點(diǎn)等位基因序列分型兩種方法對(duì)40株大腸桿菌進(jìn)行分子分型，結(jié)果顯示通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)把40株大腸桿菌分成A～S共19個(gè)克隆株，除了C型、F型、G型、I型、K

11、型、M型和R型屬于多克隆株外，其他12種克隆菌株都屬于單一克隆，證明豬源和水源碳青霉烯不敏感大腸桿菌以單克隆傳播為主，其中5株產(chǎn)KPC-2酶大腸桿菌分成5個(gè)克隆株，5株產(chǎn)NDM-1酶大腸桿菌分為4個(gè)克隆株;通過(guò)多位點(diǎn)等位基因序列分型方法將40株大腸桿菌分成了15個(gè)ST型，其中除了包括CC10、CC23、CC38和CC405共4個(gè)克隆復(fù)合體外，其他11個(gè)ST型都屬于單一序列型，攜帶KPC-2酶大腸桿菌屬于ST69、ST131、ST405、

12、ST410和ST648五種不同的ST型，攜帶NDM-1大腸桿菌屬于ST72、ST131、ST167和ST410四種不同的ST型。運(yùn)用系統(tǒng)發(fā)育群分組分型方法對(duì)40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌進(jìn)行分型，結(jié)果24株屬于致病力弱的A型和B1型，16株屬于致病力強(qiáng)的B2型和D型，攜帶KPC-2酶大腸桿菌有3株屬于強(qiáng)致病力組，2株屬于弱致病力組，攜帶NDM-1酶大腸桿菌有4株屬于弱致病力組，只有1株屬于強(qiáng)致病力組，同時(shí)具備強(qiáng)致病力和強(qiáng)耐藥性的菌株對(duì)人醫(yī)

13、臨床是個(gè)威脅。
　　運(yùn)用接合實(shí)驗(yàn)的方法驗(yàn)證碳青霉烯耐藥機(jī)制的可轉(zhuǎn)移性，結(jié)果顯示40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中12株接合成功，攜帶KPC-2酶的5株大腸桿菌和攜帶NDM-1的大腸桿菌都接合成功，并在接合子中擴(kuò)增到了相應(yīng)的基因，證明了blaKP C-2基因和blaDM-1基因位于質(zhì)粒上可以水平移動(dòng)，在接合成功的產(chǎn)KPC-2酶接合子中擴(kuò)增到了兩種質(zhì)粒復(fù)制子分別為IncN和IncA/C，在產(chǎn)NDM-1酶接合子中也擴(kuò)增到了兩種質(zhì)粒復(fù)制子分別

14、為IncA/C和IncFⅡ，證明是這三種質(zhì)粒介導(dǎo)了blaKPC-2基因和blaNDM-1的水平傳播。
　　采用引物步移法對(duì)5株產(chǎn)NDM-1酶大腸桿菌中的blaNDM-1基因周圍環(huán)境進(jìn)行分析，結(jié)果顯示blaNDM-1基因具有三種不同的基因環(huán)境，其中一種基因環(huán)境和鮑曼不動(dòng)桿菌中blaNDM-1基因環(huán)境完全吻合，證明耐藥質(zhì)粒在腸桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌之間發(fā)生了傳遞，另外兩種是典型的腸桿菌中blaNDM-1基因環(huán)境特征。
　　體外構(gòu)建含