質(zhì)粒編碼的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-55及碳青霉烯酶NDM-1和IMP-1的分子遺傳特征研究.pdf

1、研究目的:
　　鑒定質(zhì)粒介導(dǎo)的臨床分離多藥耐藥(MDR)菌株的β-內(nèi)酰胺酶類型,明確酶的編碼基因、基因座位以及可移動(dòng)元件導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的遺傳進(jìn)化作用,從而追溯超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和碳青霉烯酶耐藥基因的來源,闡明質(zhì)粒編碼的腸桿菌科細(xì)菌和非發(fā)酵菌獲得性耐藥的分子遺傳特征。
　　研究方法:
　　對(duì)臨床收集的MDR腸桿菌科細(xì)菌和非發(fā)酵菌進(jìn)行細(xì)菌耐藥譜分析和產(chǎn)酶初篩,選定青霉素類和頭孢菌素類耐藥＃1081(來自浙

2、江省痢疾患者糞便標(biāo)本)、碳青霉烯類耐藥3-SP(來自陜西省肺炎患者痰標(biāo)本)和碳青霉烯類、呋喃類及氨基糖苷類均耐藥的A22732(來自北京市肺炎患者痰標(biāo)本)為研究對(duì)象。通過生化、質(zhì)譜和16sRNA基因鑒定菌種;測(cè)定菌株MIC值,利用雙紙片協(xié)同法、改良Carba NP法、PCR技術(shù)鑒定β內(nèi)酰胺酶類型和耐藥基因分型;通過接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)判斷耐藥基因是否通過質(zhì)粒傳遞,比較含有不同β-內(nèi)酰胺酶基因接合子的耐藥譜;采用 DNA測(cè)序技術(shù)分析耐藥基因座位及

3、其上下游序列,通過引物延伸實(shí)驗(yàn)確定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),推斷耐藥基因啟動(dòng)子;最終在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)耐藥質(zhì)粒的同源性,追溯耐藥基因來源,分析整合子、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)元件對(duì)細(xì)菌獲得性耐藥的遺傳進(jìn)化作用,明確菌株耐藥的分子遺傳特征。
　　研究結(jié)果:
　　經(jīng)鑒定菌株＃1081、3-SP和A22732菌株分別為宋內(nèi)志賀菌(S.sonnei)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)和木糖氧化無色桿菌(A. xylosoxidans);其中宋內(nèi)志賀

4、菌＃1081產(chǎn) ESBLs,攜帶 blaCTX-M-55基因,產(chǎn)氣腸桿菌3-SP和木糖氧化無色桿菌 A227323產(chǎn)碳青霉烯酶金屬酶(MBLs),3-SP攜帶blaNDM-1基因,A227323攜帶blaIMP-1基因,且基因均位于可接合性質(zhì)粒上。宋內(nèi)志賀菌＃1081的耐藥性完全由攜帶唯一耐藥基因blaCTX-M-55的可接合性質(zhì)粒p1081-CTXM介導(dǎo),其中插入序列ISEcp1是獲得ESBLs blaCTX-M-55基因的轉(zhuǎn)座元件。

5、p1081-CTXM同源于狗糞便質(zhì)粒,提示該耐藥質(zhì)粒在寵物非致病性大腸桿菌與人類致病性宋內(nèi)志賀菌之間形成了的跨物種傳播。產(chǎn)氣腸桿菌3-SP接合子全部獲得3-SP的碳青霉烯類抗生素耐藥表型,甚至對(duì)單酰胺類抗生素耐藥,揭示出可接合性質(zhì)粒p3SP-NDM攜帶的NDM-1耐藥基因具有超強(qiáng)β-內(nèi)酰胺酶活性。p3SP-NDM攜帶多個(gè)耐藥基因和多個(gè)插入序列,其中兩個(gè)插入序列ISAba125構(gòu)成的轉(zhuǎn)座子是blaNDM-1的轉(zhuǎn)座元件。該質(zhì)粒同源于北京魯氏

6、不動(dòng)桿菌的質(zhì)粒 pNDM-BJ01,說明攜帶 NDM-1的 pNDM-BJ01質(zhì)粒已在中國(guó)的腸桿菌科和非發(fā)酵菌中形成跨地區(qū)跨種屬的水平傳播。木糖氧化無色桿菌A22732接合子部分獲得A22732的碳青霉烯類藥物抗性表型,說明除了產(chǎn)IMP-1酶外還有其他耐藥機(jī)制參與野生株的碳青霉烯耐藥。我們首次發(fā)現(xiàn)A22732的可接合性質(zhì)粒pA22732-IMP存在一種新型1類整合子,該整合子捕獲基因盒aacA7-blaIMP-1并為之提供啟動(dòng)子Pc。通

7、過比對(duì)與之同源的質(zhì)粒序列pAKD31(挪威耕地)、pDB1(韓國(guó)土壤)和pB8(俄羅斯污水),發(fā)現(xiàn)捕獲耐藥基因的整合子在pAKD31和pDB1的基因重組熱點(diǎn)區(qū)域發(fā)生了基因重組事件,導(dǎo)致了耐藥質(zhì)粒pA22732-IMP和pB8的產(chǎn)生。
　　研究結(jié)論:
　　可接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等可移動(dòng)元件(MGEs)介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer,HGT),導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的跨物種、跨種