產(chǎn)NDM-1型碳青霉烯酶大腸埃希菌的研究.pdf

1、目的：
　　碳青霉烯類抗生素是治療嚴(yán)重院內(nèi)感染的強(qiáng)力有效藥物，尤其是對產(chǎn)ESBLs酶、AmpC酶的耐藥腸桿菌科細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染。隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛和不規(guī)范使用，臨床上對該類藥物耐藥的革蘭陰性桿菌也越來越多。產(chǎn)生碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。近年來發(fā)現(xiàn)一種新的碳青霉烯酶——NDM-1具有嚴(yán)重的耐藥性而引起全世界的廣泛關(guān)注。本文通過對碳青霉烯類抗生素耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行篩查并檢測相關(guān)

2、耐藥基因，旨在了解近年來本地區(qū)產(chǎn)NDM-1腸桿菌科細(xì)菌的分布情況;分析NDM-1耐藥基因在菌株間的轉(zhuǎn)移機(jī)制，研究NDM-1的播散機(jī)制。
　　方法：
　　應(yīng)用VITEK全自動(dòng)微生物分析儀對2010年08月至2013年04月分離于我院的碳青霉烯類抗生素（亞胺培南、美羅培南、厄他培南）耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。采用PCR檢測這些對碳青霉烯類抗生素耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細(xì)菌NDM-1基因，對NDM-1陽性

3、菌進(jìn)行改良Hogde試驗(yàn)、金屬酶初篩試驗(yàn)、ESBLs檢測、AmpC酶頭孢西丁三維試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增分析是否攜帶其他耐藥基因，包括其他碳青霉烯酶耐藥基因、ESBLs基因、質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因、喹諾酮類耐藥基因和16S rRNA甲基化酶基因。接合、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)驗(yàn)證NDM-1基因是否位于質(zhì)粒上，是否可接合轉(zhuǎn)移。采用E-test法檢測NDM-1陽性菌、接合子或轉(zhuǎn)化子的MIC值。對NDM-1陽性菌的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切對比，證實(shí)是否為同一質(zhì)粒的播散。

4、運(yùn)用MLST分析NDM-1陽性菌的克隆型，證實(shí)在同種菌種中是否是同一克隆型的播散。
　　結(jié)果：
　　1.菌株篩選和藥敏結(jié)果:分離到2株攜帶NDM-1基因的大腸埃希菌(編號為WZ33，WZ51)，WZ33為尿液標(biāo)本，WZ51為痰液標(biāo)本。這2株大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素均呈高水平耐藥，對氨曲南、慶大霉素、左氧氟沙星耐藥。轉(zhuǎn)化子對亞胺培南、美羅培南、厄他培南及其他β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性提高，但仍在中介-耐藥水平。
　

5、　2.表型檢測:2株大腸埃希菌改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果為均陰性;EDTA雙紙片增效試驗(yàn)初篩金屬酶顯示均為陽性;經(jīng)頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸及頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸雙紙片協(xié)同法檢測ESBLs，結(jié)果均陰性;頭孢西丁三維試驗(yàn)結(jié)果均為陽性。
　　3.耐藥基因檢測:經(jīng)PCR擴(kuò)增測序，2株大腸桿菌NDM-1基因陽性;經(jīng)PCR檢測及DNA測序，發(fā)現(xiàn)WZ33還攜帶blaCTX-M-14和blaCYM-42，WZ51攜帶blaCTX-M-14

6、、 blaSHV-12及blaCMY-42;未檢測到其他碳青霉烯酶基因、喹諾酮類及16S rRNA甲基化酶基因。
　　4.接合和轉(zhuǎn)化試驗(yàn):經(jīng)反復(fù)多次接合試驗(yàn)，2株大腸埃希菌均未得到接合子。將從臨床菌株抽提的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入DH5α受體菌中，經(jīng)亞胺培南篩選平板獲得轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序，證實(shí)含有blaNDM-1，WZ51還同時(shí)含blaSHV-12。
　　5.質(zhì)粒譜分析:質(zhì)粒電泳顯示，WZ33臨床株含有2個(gè)質(zhì)粒，分別

7、約為65kb和3kb;轉(zhuǎn)化子含1個(gè)質(zhì)粒約65kb; WZ51臨床株含有3個(gè)質(zhì)粒，分別約為65kb、7kb和3kb;其轉(zhuǎn)化子含有1個(gè)約65kb的質(zhì)粒。WZ33和WZ51轉(zhuǎn)化子提取的質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，結(jié)果示所含質(zhì)粒并不相同。
　　6.MLST分型:選擇大腸埃希菌的7個(gè)管家基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增和DNA測序后，發(fā)現(xiàn)這2株大腸埃希菌的克隆分型均為ST167。
　　結(jié)論：
　　首次在溫州地區(qū)發(fā)現(xiàn)2株克隆相關(guān)的產(chǎn)NDM