產NDM-1型碳青霉烯酶大腸埃希菌的研究.pdf

1、目的：
　　碳青霉烯類抗生素是治療嚴重院內感染的強力有效藥物，尤其是對產ESBLs酶、AmpC酶的耐藥腸桿菌科細菌引起的嚴重感染。隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛和不規(guī)范使用，臨床上對該類藥物耐藥的革蘭陰性桿菌也越來越多。產生碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。近年來發(fā)現(xiàn)一種新的碳青霉烯酶——NDM-1具有嚴重的耐藥性而引起全世界的廣泛關注。本文通過對碳青霉烯類抗生素耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細菌進行篩查并檢測相關

2、耐藥基因，旨在了解近年來本地區(qū)產NDM-1腸桿菌科細菌的分布情況;分析NDM-1耐藥基因在菌株間的轉移機制，研究NDM-1的播散機制。
　　方法：
　　應用VITEK全自動微生物分析儀對2010年08月至2013年04月分離于我院的碳青霉烯類抗生素（亞胺培南、美羅培南、厄他培南）耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細菌進行鑒定和藥敏試驗。采用PCR檢測這些對碳青霉烯類抗生素耐藥或敏感性下降的腸桿菌科細菌NDM-1基因，對NDM-1陽性

3、菌進行改良Hogde試驗、金屬酶初篩試驗、ESBLs檢測、AmpC酶頭孢西丁三維試驗，PCR擴增分析是否攜帶其他耐藥基因，包括其他碳青霉烯酶耐藥基因、ESBLs基因、質粒介導的AmpC酶基因、喹諾酮類耐藥基因和16S rRNA甲基化酶基因。接合、轉化試驗驗證NDM-1基因是否位于質粒上，是否可接合轉移。采用E-test法檢測NDM-1陽性菌、接合子或轉化子的MIC值。對NDM-1陽性菌的轉化子質粒進行酶切對比，證實是否為同一質粒的播散。

4、運用MLST分析NDM-1陽性菌的克隆型，證實在同種菌種中是否是同一克隆型的播散。
　　結果：
　　1.菌株篩選和藥敏結果:分離到2株攜帶NDM-1基因的大腸埃希菌(編號為WZ33，WZ51)，WZ33為尿液標本，WZ51為痰液標本。這2株大腸埃希菌對β-內酰胺類抗生素均呈高水平耐藥，對氨曲南、慶大霉素、左氧氟沙星耐藥。轉化子對亞胺培南、美羅培南、厄他培南及其他β-內酰胺類抗生素的敏感性提高，但仍在中介-耐藥水平。
　

5、　2.表型檢測:2株大腸埃希菌改良Hodge試驗結果為均陰性;EDTA雙紙片增效試驗初篩金屬酶顯示均為陽性;經頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸及頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸雙紙片協(xié)同法檢測ESBLs，結果均陰性;頭孢西丁三維試驗結果均為陽性。
　　3.耐藥基因檢測:經PCR擴增測序，2株大腸桿菌NDM-1基因陽性;經PCR檢測及DNA測序，發(fā)現(xiàn)WZ33還攜帶blaCTX-M-14和blaCYM-42，WZ51攜帶blaCTX-M-14

6、、 blaSHV-12及blaCMY-42;未檢測到其他碳青霉烯酶基因、喹諾酮類及16S rRNA甲基化酶基因。
　　4.接合和轉化試驗:經反復多次接合試驗，2株大腸埃希菌均未得到接合子。將從臨床菌株抽提的質粒通過化學轉化方法導入DH5α受體菌中，經亞胺培南篩選平板獲得轉化子，經PCR擴增和測序，證實含有blaNDM-1，WZ51還同時含blaSHV-12。
　　5.質粒譜分析:質粒電泳顯示，WZ33臨床株含有2個質粒，分別

7、約為65kb和3kb;轉化子含1個質粒約65kb; WZ51臨床株含有3個質粒，分別約為65kb、7kb和3kb;其轉化子含有1個約65kb的質粒。WZ33和WZ51轉化子提取的質粒經EcoRⅠ限制性內切酶酶切，結果示所含質粒并不相同。
　　6.MLST分型:選擇大腸埃希菌的7個管家基因，經PCR擴增和DNA測序后，發(fā)現(xiàn)這2株大腸埃希菌的克隆分型均為ST167。
　　結論：
　　首次在溫州地區(qū)發(fā)現(xiàn)2株克隆相關的產NDM