NDM-1耐藥菌在中國的流行及特性研究.pdf

1、目前，我國產(chǎn)NDM-1耐藥菌的流行情況、攜帶NDM-1菌株的特性及其播散的機制仍不清楚。國外NDM-1攜帶者多有印度和巴基斯坦旅行和醫(yī)療史，印度被認為是NDM-1耐藥菌的輸出國家，我國與印度毗鄰，其NDM-1耐藥菌的流行是否和印度有關仍沒有明確定論。
　　研究證明人體腸道是重要的耐藥基因庫，致病菌可以在腸道內發(fā)生接合轉移獲得耐藥基因，在腸道定植的菌中攜帶的耐藥基因有一半與致病菌中相同，因此美國疾病預防控制中心推薦通過采集患者糞便標

2、本來篩查CRE（耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細菌）攜帶者，以便及時采取措施預防和控制感染?；谏鲜鲅芯?，從2011年4月至2011年10月，在全國范圍內選取了11個城市22家醫(yī)院，共收集了3001份糞便樣本，常規(guī)PCR和陽性產(chǎn)物再測序篩選NDM-1陽性樣本，然后從鑒定為陽性的樣本中分離出NDM-1耐藥菌，利用BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因測序進行菌種鑒定。其中對分離出的不動桿菌屬細菌再次利用16S-23S rRNA

3、 ITS區(qū)序列和rpoB基因序列測序進行菌種鑒定。
　　在篩查的3001份樣本中，一共鑒定出329份陽性樣本，平均陽性率為11％，陽性率較高的城市有重慶(17.6％)和成都(17.2％)，較低的有南京(4.0％)和烏魯木齊(4.4％)，在所有調查的城市中均存在陽性樣本。從329份陽性的菌液中，一共分離出63株NDM-1陽性菌，菌種鑒定結果顯示數(shù)目最多的是不動桿菌屬細菌（30株），其次是腸球菌（10株）。含NDM-1的菌種種類較多，

4、分別屬于不同的16個屬的細菌，其中共發(fā)現(xiàn)18個未報道過的含NDM-1的耐藥菌。另外發(fā)現(xiàn)有些陽性樣本分離出不止一株NDM-1耐藥菌，其中有9個樣本每個樣本分離出2個不同的NDM-1耐藥菌，還有1個樣本分離出3株不同的NDM-1陽性菌，在這10個特殊的樣本中有9個樣本中分離的菌中含有不動桿菌。另外病例資料顯示收集的患者均無出國醫(yī)療史。
　　通過上述研究發(fā)現(xiàn)NDM-1耐藥菌在醫(yī)院患者身上攜帶率較高，已經(jīng)在全國范圍內流行和傳播;我國分離的

5、NDM-1菌株的菌種類型獨特，以不動桿菌屬細菌(30/63)和腸球菌屬細菌(10/63)多見;不動桿菌屬細菌在中國NDM-1的傳播過程中起到了重要作用，不動桿菌屬細菌可能是NDM-1基因的保存宿主;我國的NDM-1耐藥菌的流行與印度可能無關。
　　對NDM-1耐藥菌的特性進行了進一步研究，首先在有抗和無抗條件下連續(xù)傳代，分析blaNDM-1基因在菌株中的遺傳穩(wěn)定性。Walsh等的研究表明不能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因的菌株不具

6、備典型的NDM-1耐藥菌的耐藥性，所以對能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因的菌株進行重點研究，首先微量肉湯稀釋法和E-test法檢測菌株對抗菌藥物的敏感性，E-test法檢測細菌金屬酶表型;然后PCR法篩選常見的耐藥基因，分析菌株的耐藥基因背景;PFGE對細菌分型，查看有無流行克隆株;Southern blot對blaNDM-1進行基因定位;接合轉移實驗評估blaNDM-1質粒轉移特性，同時微量肉湯稀釋法評估了blaNDM-1陽性接合子的

7、耐藥性。
　　發(fā)現(xiàn)在63株NDM-1耐藥菌中只有30株不動桿菌屬的細菌能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因，在有抗和無抗的壓力下連續(xù)培養(yǎng)5代，所有的菌株未出現(xiàn)blaNDM-1基因丟失現(xiàn)象，然而其余菌株，包括一株大腸埃希菌和產(chǎn)酸克雷伯菌在內的15個屬種的細菌在無抗的壓力下連續(xù)傳代培養(yǎng)1-3代，blaNDM-1基因均發(fā)生丟失。體外的藥敏實驗表明30株不動桿菌表現(xiàn)出相似的表型耐藥模式，對頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)出高水平耐藥，對氨基糖

8、苷類抗生素、喹諾酮類抗生素及單酰胺環(huán)類抗生素（氨曲南）耐藥表現(xiàn)不一致:10株測試菌對氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)為敏感，其余菌株(20/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥;3株測試菌對喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為敏感，其余菌株(27/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥;17株測試菌對氨曲南表現(xiàn)為敏感，其余菌株(13/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥;30株測試株中，29株對替加環(huán)素表現(xiàn)為敏感，24株對黏菌素表現(xiàn)為敏感。攜帶NDM-1的不動桿菌屬細菌金屬酶表型均為陽性。耐藥基

9、因背景篩查結果顯示在30株不動桿菌屬細菌，有22株細菌含有其他耐藥基因。PFGE結果顯示不動桿菌屬細菌帶型差異較大，沒有發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢克隆株。Southern blot結果顯示30個不動桿菌中有26個菌blaNDM-1位于質粒上，質粒大小相似，在30-60kb范圍內，其余4個菌blaNDM-1位于染色體上。接合轉移實驗顯示有23個菌株中的blaNDM-1質粒發(fā)生了轉移，接合轉移效率較高，達到10-2，同時藥敏結果顯示陽性接合子普遍對頭孢菌素類

10、抗生素表現(xiàn)為耐藥，然而只有部分菌株(8/23)遺傳NDM-1原始菌株的耐藥性，對碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)耐藥，其余接合子(15/23)對其表現(xiàn)敏感。
　　通過上述研究發(fā)現(xiàn)NDM-1陽性的不動桿菌屬細菌并非泛耐藥菌，體外實驗表明除替加環(huán)素和黏菌素外，多數(shù)菌株還對氨曲南保持敏感。blaNDM-1基因能夠穩(wěn)定地存在于不動桿菌攜帶的質粒上，并且這些質粒能夠高效地發(fā)生接合轉移，這對blaNDM-1基因的傳播具有重要意義。
　　為了研究bl

11、aNDM-1基因所在的質粒及周圍序列特征，以期從分子水平上揭示耐藥基因的產(chǎn)生及傳播機制。本研究提取細菌的質粒利用Ion TorrentTM平臺進行測序，然后普通PCR測序補充gap，同時驗證質粒全序。RAST對質粒進行注釋，Blastp進行驗證。利用Mauve和CLC Genomics Workbench軟件對所有blaNDM-1質粒進行分析，對比所有的質粒，找出它們的區(qū)別和差異，同時對blaNDM-1基因上下游序列進行分析，對于bla

12、NDM-1基因位于染色體上的4個菌，PCR mapping推測其上下游序列。結合有關NDM-1的文獻，推測NDM-1的傳播和流行規(guī)律。
　　blaNDM-1質粒測序結果顯示，有14個質粒與已經(jīng)公布的4個質粒相同（pNDM-BJ01、pNDM-BJ02、pM131_NDM-1和pAbNDM-1），這4個質粒本身之間相似性較高，達到80％;另外10個質粒為新的質粒，對比分析之后，發(fā)現(xiàn)這10個質粒與上述的4個質粒仍然有較高的相似性(70

13、％-90％)。由此得到不動桿菌屬細菌中blaNDM-1質粒保守，質粒間的相似程度較高，質粒的不同多為在轉移的過程中不動桿菌屬細菌中常見的插入序列整合引起的。
　　同時實驗發(fā)現(xiàn)兩個結構全新的質粒，pNDM-GJ01和pNDM-GJ02，pNDM-GJ01擁有一個新的質粒骨架，BLAST結果顯示除了Tn125外，NCBI中沒有與pNDM-GJ01相似的序列。另外對pNDM-GJ02的結構進行分析顯示，質粒pNDM-GJ02上有兩段分別

14、與鮑曼不動桿菌中質粒pBJAB0715和Acinetobacter sp.MDS7A染色體上序列有較高的同源性(97％-100％)，除此之外，質粒還含兩個完整的復合轉座子，Tn125和IS26復合轉座子，pNDM-GJ02質粒的形成可能是由多次重組事件造成的。由此不動桿菌屬細菌中blaNDM-1新質粒的產(chǎn)生是Tn125移動整合的結果。blaNDM-1基因通過轉座元件在不同質粒間傳播，繼而以質粒為轉移元件繼續(xù)播散。
　　通過比對30

15、株不動桿菌屬細菌中blaNDM-1基因周圍序列，發(fā)現(xiàn)blaNDM-1位于Tn125-like結構上，周圍序列非常保守。結合文獻認為blaNDM-1基因可能來源于不動桿菌屬細菌，不動桿菌屬細菌是blaNDM-1基因的天然宿主，blaNDM-1基因可以通過轉座元件轉移至肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中，再次引起爆發(fā)流行。
　　另外發(fā)現(xiàn)了NDM-1的一個新的突變體，命名為NDM-14。為了研究新的突變體的特性，首先比較攜帶NDM-1和NDM-

16、14原始菌株的耐藥性差別，同時構建兩種克隆株比較耐藥性差異，最后利用合適的載體，經(jīng)過兩次純化得到無標簽的NDM蛋白，通過酶動力學實驗研究酶的各項特征。實驗結果顯示，與攜帶NDM-1的菌株相比，攜帶NDM-14的菌株耐藥性增強，這種情況在原始啟動子存在的情況下尤為明顯。酶動力參數(shù)表明，與NDM-1相比，NDM-14對美羅培南，亞胺培南和氨芐西林的親和力增強。
　　綜上所述，推測:
　　1)我國產(chǎn)NDM-1菌株是個獨立進化的過程