中國部分地區(qū)碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌耐藥機制及分子流行病學(xué)研究.pdf

1、一、背景：
　　 銅綠假單胞菌是目前臨床上常見的革蘭陰性桿菌,廣泛存在于自然環(huán)境中,也可存在于健康人體皮膚、呼吸道等部位.它是一種條件致病菌,易發(fā)生在免疫力受損的宿主身上.目前隨著臨床上廣譜抗生素、激素、化療藥物等免疫抑制劑的大量使用,銅綠假單胞菌耐藥現(xiàn)象越來越嚴重,出現(xiàn)了多重耐藥及泛耐藥菌株,且有不斷上升趨勢,給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。碳青霉烯類抗生素是目前臨床革蘭陰性菌重癥感染治療的常用藥物,能有效治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

2、(extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)和產(chǎn)頭孢菌素酶(AmpC酶)的革蘭陰性菌感染。但隨之而來的碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA)菌株也不斷增加,成為臨床銅綠假單胞菌感染治療中的棘手問題。
　　 銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的原因主要有:β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生、外膜孔蛋白OprD2的缺失、主動外

3、排系統(tǒng)的過度表達等,3種耐藥機制單獨或共同作用引起對碳青霉烯類藥物的耐藥。
　　 本研究收集了我國16個城市28家醫(yī)院2006年7月到2007年7月臨床分離的645株銅綠假單胞菌菌株,檢測其對碳青霉烯類抗生素等抗菌藥物的敏感性,并對碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的分子流行病學(xué)及耐藥機制進行研究。
　　 二、材料與方法：
　　 收集2006年7月-2007年7月我國16個城市(杭州、臺州、上海、南京、廣州、深圳、哈爾濱、

4、沈陽、石家莊、北京、天津、西安、武漢、長沙、重慶、蘭州)28家醫(yī)院臨床645株非重復(fù)的銅綠假單胞菌菌株。采Kirby-Bauer紙片法和瓊脂擴散法進行藥敏檢測；脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)及多位點序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)進行菌株的同源性分析；Etest條檢測金屬酶；PCR擴增β-內(nèi)酰胺酶基因(ESBLs、碳青霉烯酶及質(zhì)粒介導(dǎo)

5、AmpC酶等)；采用逆轉(zhuǎn)錄熒光實時定量PCR(Real-time RT PCR)測定碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌菌株外膜孔蛋白OprD2、外排泵MexAB-OprM以及染色體介導(dǎo)AmpC酶的相對表達量；PCR擴增外膜孔蛋白OprD2基因全長并序列分析；采用卡方檢驗對抗菌藥物耐藥性進行分析。
　　 三、結(jié)果：
　　 1、藥敏結(jié)果；
　　 645株銅綠假單胞菌菌株對亞胺培南及美羅培南的不敏感率分別為38.4％(2

6、48／645)及35.2％(227／645),其中258株菌株對碳青霉烯類抗生素(亞胺培南或美羅培南)耐藥,40％(258／645).其中227株菌株為多重抗菌藥物耐藥菌株,占碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的88.0％(227／258)；對11種抗菌藥物全部耐藥菌株(泛耐藥菌株)為28株,占4.3％。
　　 2、PFGE同源性分析及多位點序列分型(MLST)；
　　 258株碳青霉烯類抗生素耐藥菌株P(guān)FGE分型及同源性分析結(jié)果

7、顯示:其中246株菌株指紋圖譜可分成89個型,其余12株菌株不能通過PFGE分型。根據(jù)MLST分型可分為64個ST型。其中55個ST型為新發(fā)現(xiàn)的ST型。
　　 3、主要β-內(nèi)酰胺酶基因分布；
　　 258株對碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌菌株中,22株菌株(8個克隆)金屬酶基因型陽性,占8.5％(22／258)。所有258株碳青霉烯類抗生素耐藥菌株OXA-50基因均陽性。OXA-10群陽性共51株,CARB型為88,

8、TEM型為98,PER型為30株,CTX-M型為9株(CTX-M-14型為38,CTX-M-13型為18,CTX-M-15型3株,CTX-M-3型2株),VEB型5株,SHV型5株。未檢測到質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶類DHA、ACC、LAT、CMY、MIR、ACT、MOX、FOX型及KPC、Sine、NMC、OXA-23等其他碳青霉烯酶基因型。
　　 4、金屬酶表型篩選結(jié)果；
　　 采用金屬酶Etest法篩選到19株產(chǎn)金屬酶菌

9、株,另外3株金屬酶基因陽性菌株不能被金屬酶Etest法檢測出,包括zy8(IMP-1),tj22(VIM-2)及ss37(VIM-2)。
　　 5、高產(chǎn)AmpC酶；
　　 258株對碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌菌株中,14株碳青霉烯類抗生素耐藥菌株高產(chǎn)Amp0c酶,僅占5.4％。
　　 6、外膜孔蛋白OprD2相對表達量及核苷酸序列；
　　 258株對碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌菌株中,206

10、株菌株存在OprD2相對表達量下降,占79.8％；158株菌株OprD2相對表達量顯著降低(<0.4),占61.2％；其中19株菌株OprD2相對表達量低于0.01,占7.4％。其中58不同克隆的碳青霉烯類抗生素耐藥菌株在OprD2基因核苷酸序列的不同位點插入了插入序列ISpa1328、ISPre2類似插入序列及IS5家族的插入序列。
　　 7、外排泵MexAB-OprM相對表達量；
　　 258株碳青霉烯類抗生素耐藥菌

11、株中,119株菌株存在外排泵MexAB-OprM顯著高表達(>2.5),占46.1％(119／258)。
　　 四、結(jié)論：
　　 1、我國銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥率高；以多克隆散發(fā)為主,部分存在院內(nèi)克隆播散。
　　 2、金屬酶及高產(chǎn)AmpC酶并不是我國銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制。
　　 3、外膜蛋白OprD2表達減少及外排泵MexAB-OprM高表達是我國臨床分離銅綠假單胞菌菌