大腸埃希菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-14亞型的研究.pdf

1、背景與目的:
　　產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases ESBLs)是導致腸桿菌科細菌對第三代頭孢菌素耐藥的最常見機制,ESBLs的主要宿主菌為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。ESBLs基因主要定位于質(zhì)粒,可水解氧亞氨基頭孢菌素類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素,其酶活性可被內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制。目前,ESBLs種類已有數(shù)百種之多,包括TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型、其它型等5類。攜帶ES

2、BLs的質(zhì)?？稍谕N甚至不同種的細菌之間傳播,造成耐藥菌株迅速增多,導致醫(yī)院感染的暴發(fā)流行,是臨床防治非常棘手的問題。目前對ESBLs的研究已經(jīng)進入亞型研究階段。由于地域、環(huán)境、醫(yī)療水平的差異,以及抗生素應用習慣不同,世界各地ESBLs流行的主要亞型及其耐藥譜有所差異。有報道表明,在我國以CTX-M型為主,其中最主要的是CTX-M-14。國內(nèi)有些地區(qū)作了這方面的調(diào)查和研究,但我省有關這方面的報道較少,尚缺乏系統(tǒng)的研究。為了解本地區(qū)臨床分

3、離大腸埃希菌中CTX-M-14型ESBLs的流行狀況、以及耐藥特征,本文對156株大腸埃希菌進行了CTX-M-14基因及表達蛋白的研究。
　　方法:
　　1.收集目的菌株:收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院2006年10月至2007年10月分離的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌156株。細菌鑒定采用雙紙片協(xié)同試驗初篩、E-test試驗確證。每株均提取質(zhì)粒,采用CTX-M-14特異性引物,聚合酶鏈反應(PCR)擴增CTX-M-14編碼基因片段,瓊

4、脂糖凝膠電泳觀察結果,統(tǒng)計CTX-M-14型ESBLs的檢出率。
　　2.目的基因的酶切、連接和轉(zhuǎn)化:膠回收陽性片段,經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后,克隆入pET28(a+)載體中,轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL-21感受態(tài)細胞,提取重組質(zhì)粒并測序,分析其氨基酸序列,證明其為目的基因CTX-M-14。
　　3.表達蛋白:采用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導CTX-M-14基因表達,超聲處理法裂解表達產(chǎn)物包涵體,用低濃度尿素透

5、析純化和復性,得到較純的CTX-M-14蛋白,按直接藥敏試驗的方法,將CTX-M-14蛋白加在水解酪蛋白(M-H)瓊脂平板表面不同藥敏紙片上,與不加CTX-M-14蛋白藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑比較來判斷酶活性。
　　4.轉(zhuǎn)化子耐藥譜分析:將BL-21-CTX-M-14轉(zhuǎn)化子采用液體稀釋法進行藥敏試驗,檢測其抗藥活性。
　　結果:
　　1.對156株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的質(zhì)粒進行PCR擴增,結果顯示67株陽性,檢出率為42

6、.9％。陽性片段在Marker750bp與1000bp之間。
　　2.PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、酶切、連接后,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL-21感受態(tài)細胞,提取轉(zhuǎn)化后CTX-M-14-BL-21大腸桿菌的重組質(zhì)粒,并經(jīng)同樣的酶切后,產(chǎn)生的片段電泳位置與PCR產(chǎn)物一致。重組質(zhì)粒經(jīng)測序分析,共測得876bp,與GeneBank中CTX-M-14基因同源性為100％。
　　3.在蛋白活性分析中,聚丙烯酞胺凝膠電泳顯示目的條帶在27.0kD與30.

7、0kD之間,與CTX-M-14蛋白28kD相符。
　　4.藥敏試驗結果顯示,轉(zhuǎn)化子對青霉素類、頭孢一、二代及三代中頭孢噻肟、頭孢曲松耐藥。對慶大霉素、四環(huán)素、喹諾酮類藥物、碳青酶烯類敏感。對加有酶抑制劑的抗菌素和頭孢他啶體外試驗均敏感。
　　結論:
　　河南地區(qū)臨床分離大腸埃希菌具有較高的CTX-M-14型ESBLs檢出率,是本地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中流行的主要基因型。在蛋白活性測定中,采用透析純化和低濃度尿素復性