產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌bla-,CTX-M-基因型及耐藥性檢測.pdf

1、近年來，隨著第三代頭孢菌素的大量使用，細(xì)菌耐藥已成為世界難題。革蘭陰性桿菌產(chǎn)生ESBLs是導(dǎo)致該類細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一<'[1]>。值得注意的是，自20世紀(jì)90年代CTX-M型ESBLs首次在歐洲報(bào)道<'[2]>以來，世界許多地區(qū)均有報(bào)道而且其基因亞型不斷增多，至今已有40余種(http：//www．lahey．org/studies/webt．htm)。目前對(duì)CTX-M型ESBLs的檢測方法還比較有限，本研究首次運(yùn)用一種全新的

2、方法對(duì)CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因型進(jìn)行檢測，同時(shí)，對(duì)產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測分析。 本實(shí)驗(yàn)分為兩部分： 第一部分：運(yùn)用變性高效液相色譜快速檢測CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因型 目的:運(yùn)用變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLc)技術(shù)對(duì)已經(jīng)確認(rèn)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spect

3、rum beta-lactamases，ESBLs)的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌臨床分離株CTX-M型質(zhì)粒進(jìn)行基因分型，探討其敏感性和特異性，試圖建立一種快速檢測CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型的新方法。 方法:利用PCR技術(shù)從50株產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌臨床分離株中擴(kuò)增出CTX-M型質(zhì)粒的編碼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物運(yùn)用DHPLc技術(shù)進(jìn)行分析和DNA測序確定其基因突變的類型，最后通過比對(duì)二者結(jié)果后確定其基因型。

4、 結(jié)果:50株產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌臨床分離株中，有34株擴(kuò)增到CTX-M型質(zhì)粒的編碼序列共35份(其中1株同時(shí)擴(kuò)增到2份CTX-M型編碼序列)。經(jīng)過DHPLc分析，15份表現(xiàn)為單一洗脫峰，其中有11份與其標(biāo)準(zhǔn)菌株CTX-M-3的相一致；4份與其標(biāo)準(zhǔn)菌株CI-X-M-9的相一致；測序確定它們的堿基序列與各自的標(biāo)準(zhǔn)株亦相一致，不存在變異，分別為CTX-M-3型和CTX-M-9型；20份表現(xiàn)為3種形態(tài)各異的異常洗脫峰(雙峰和

5、三峰)，其中有17份表現(xiàn)為其中一種異常洗脫峰，有2份為另一種異常洗脫峰，有1份為第3種異常洗脫峰，測序結(jié)果表明這20份標(biāo)本與其標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)比均存在著基因突變，并且DHPLc中異常峰一致的標(biāo)本均為同一基因亞型，它們分別為CTX-M-14、CTX-M-19和CTX-M-13。 第二部分：產(chǎn)CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐藥性分析 目的:了解產(chǎn)CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌和肺炎克

6、雷伯菌的耐藥情況。 方法:采用針對(duì)SHV和TEM基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增確定β-內(nèi)酰胺酶基因型；運(yùn)用改良三維實(shí)驗(yàn)法檢測菌株產(chǎn)AmpC酶情況；運(yùn)用Kirby-Bauer瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行菌株的藥物敏感性測定。 結(jié)果:第一部分中的34株產(chǎn)CTX-M酶菌株中有28株同時(shí)產(chǎn)2種或2種以上的β-內(nèi)酰胺酶；產(chǎn)CTX-M酶菌株對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢呋辛鈉、哌拉西林、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他

7、啶、頭孢西丁、慶大霉素、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、亞胺培南和美洛培南的耐藥率分別是100％(34/34)、100％(34/34)、100％(34/34)、100％(34/34)、100％(34/34)、100％(34/34)、97.1％(33/34)、52.9％(18/34)、52.9％(18/34)、32.4％(11/34)、38.2％(13/34)、76.5％(26/34)、23.5％(8/34)、64.7％(22/34)、0(0

8、/34)、0(0/34)；不產(chǎn)CTX-M酶菌株對(duì)上述藥物的耐藥率分別是100％(16/16)、93.7％(15/16)、75.0％(12/16)、68.7％(11/16)、93.7％(15/16)、93.7％(15/16)、56.2％(9/16)、18.7％(3/16)、6.25％(1/16)、75.0％(12/16)、62.5％(10/16)、62.5％(10/16)、37.5％(6/16)、75.0％(12/16)、0(0/16)、

9、0(0/16)。產(chǎn)CTX-M酶菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥水平高于不產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株(p<0.05)，對(duì)頭孢他啶的耐藥水平低于后者(p<0.01)。 全文結(jié)論： 1．每一種CTX-M基因亞型均具有特定的洗脫峰型，DHPLc可應(yīng)用于CTX-M型ESBLs的基因型檢測，準(zhǔn)確性較高，具有簡便快捷、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)： 2．產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中CTX-M基因亞