腸桿菌科細(xì)菌中CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和質(zhì)粒AmpC酶的研究.pdf

1、質(zhì)粒型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases，ESBLs)和染色體頭孢菌素酶(AmpC)是腸桿菌科細(xì)菌對新的廣譜頭孢菌素、氨曲南等耐藥的重要原因。近年的研究顯示，AmpC酶可以與ESBLs同時(shí)存在于同一個(gè)質(zhì)粒上，攜帶此質(zhì)粒的菌株對除碳青霉烯類以外的所有β-內(nèi)酰胺類耐藥，這樣的質(zhì)粒若在菌株之間傳播，將會(huì)對臨床治療和院內(nèi)感染控制造成極大的困難。對于ESBLs的具體型別，世界各地研究報(bào)告有所差異，而中

2、國臨床分離的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細(xì)菌主要產(chǎn)CTX-M型ESBLs對于質(zhì)粒AmpC酶的型別，世界各地研究報(bào)告大致相同，主要為DHA-1型AmpC酶，其次為CMY-2型。為了解華山醫(yī)院2005年臨床分離大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs和質(zhì)粒AmpC酶的基因型，我們進(jìn)行了以下3個(gè)方面的研究。 第一部分一種簡單的同時(shí)鑒定和檢測產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的方法 目前，在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中，通常采用CLSI推薦的酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢

3、測大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌中的ESBLs檢測ESBLs時(shí)，常選用頭孢噻肟和頭孢他啶兩種第三代頭孢菌素作為篩選ESBLs的底物。但據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，在中國，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌所產(chǎn)的ESBLs大多數(shù)為CTX．型ESBLs,此酶對頭孢噻肟的水解能力特別強(qiáng)。 CHROMagar 是一種專用于鑒定尿道感染病原菌的產(chǎn)色瓊脂，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分別在上面產(chǎn)生粉紅色和濕潤鐵藍(lán)色菌落。其原理是大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌在生

4、長代謝過程中產(chǎn)生酶與培養(yǎng)基中的顯色底物發(fā)生反應(yīng)而變色。在本研究中，我們通過采用這種能特異性鑒定大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的CHROMagar產(chǎn)色瓊脂，并結(jié)合64μg/mL，的頭孢噻肟，建立一種能同時(shí)達(dá)到鑒定細(xì)菌并檢測鑒定菌產(chǎn)生ESBLs功能的簡易方法，供臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。建立的簡易方法并和CLSI推薦的ESBLs確認(rèn)方法一酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)進(jìn)行比較。 結(jié)果顯示，采用CLSI推薦的酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)確認(rèn)檢測260株大腸埃希菌中，ES

5、BLs的檢出率為67.3％(175/260)，肺炎克雷伯菌中ESBLs的檢出率為69.7％ (200/287)。CHROMagar產(chǎn)色瓊脂結(jié)合64μg/mL頭孢噻肟對上述細(xì)菌中的ESBLs的檢出率分別為66.1％(172/260)和68.6％(197/287)。兩種方法產(chǎn)ESBLs菌株檢出符合率為99.6％，靈敏度為98.3％～98.5％，特異性為100％。含64μg/mL頭孢噻肟的CHROMagar產(chǎn)色瓊脂可以同時(shí)用于菌種鑒定

6、和產(chǎn)ESBLs菌株的檢測。 第二部分疑似產(chǎn)ESBLs但頭孢吡肟敏感的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細(xì)菌中ESBLs和質(zhì)粒AmpC酶的研究 在運(yùn)用CLSI推薦的酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測臨床分離的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細(xì)菌中產(chǎn)ESBLs菌株時(shí)，往往會(huì)遇到細(xì)菌對頭孢噻肟和/或頭孢他啶耐藥，但頭孢噻肟/克拉維酸和/或頭孢他啶/克拉維酸的抑菌圈直徑分別與上述單藥的抑菌圈直徑之差<5mm，無法判斷這些菌株產(chǎn)生ESBLs的屬性。推測上述細(xì)菌可能同

7、時(shí)產(chǎn)生ESBLs和AmpC酶。由于AmpC酶的活性不能被克拉維酸所抑制，其產(chǎn)生的耐藥表型覆蓋了ESBLs產(chǎn)生的耐藥表型。因此可導(dǎo)致ESBLs檢測出現(xiàn)假陰性結(jié)果。我們對2005年上海華山醫(yī)院臨床分離的20株疑似產(chǎn)ESBLs但頭孢吡肟敏感的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細(xì)菌進(jìn)行了ESBLs和質(zhì)粒AmpC酶的研究。 結(jié)果顯示，20株疑似產(chǎn)ESBLs但頭孢吡肟敏感的大腸埃希菌和克雷伯菌屬細(xì)菌主要產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶。7株克雷伯菌屬細(xì)菌有6株

8、產(chǎn)DHA-1型AmpC酶，13株大腸埃希菌中有10株產(chǎn)CMY-2型.AmpC酶。2株產(chǎn)DHA-1型AmpC酶的肺炎克雷伯菌中還分別伴隨產(chǎn)生SHV-62型和CTX-M-14型ESBL。編碼ESBLs和DHA或CMY型質(zhì)粒AmpC酶的基因可隨同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移接合轉(zhuǎn)移至敏感細(xì)胞中。PFGE結(jié)果顯示，6株肺炎克雷伯菌的譜型均不相同；而11株大腸埃希菌中有7株譜型完全一致，7株譜型完全一致的菌株中有5株來源于同一病房(6病房)，另外2株分別來自27病

9、房和門診病人。這7株細(xì)菌中除一株分離時(shí)間較早外(2005年3月)，其余6株在1個(gè)半月內(nèi)分離到(2005年11月～2005年12月)，所有7株細(xì)菌均產(chǎn)生CMY-2型質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，提示存在克隆菌株爆發(fā)流行的可能。 第三部分一株同時(shí)產(chǎn)CTX-M-14型ESBL、DHA-1型質(zhì)粒AmpC酶、qnrB-4和qnrS-1基因的肺炎克雷伯菌的研究 上述第二部分的研究中發(fā)現(xiàn)20株大腸埃希菌和克雷伯菌屬細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：有1

10、6株細(xì)菌同時(shí)對頭孢噻肟和喹諾酮類等抗菌藥物耐藥。因此我們采用PCR技術(shù)對上述菌株進(jìn)行質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥基因qnr基因進(jìn)行檢測，并同時(shí)采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)、Southern雜交、PCR 等分子生物學(xué)技術(shù)對CTX-M-14型ESBL、DHA-1型質(zhì)粒AmpC酶和qnr 等耐藥基因進(jìn)行了基因定位研究。 PCR檢測qnr 基因結(jié)果顯示，7株克雷伯菌屬細(xì)菌中有6株qnrB基因檢測陽性，其中一株肺炎克雷伯菌(菌種號為05-2250)同

11、時(shí)檢出qnrS基因。而13株大腸埃希菌中無一株檢出qnr 基因。 PCR檢測結(jié)果顯示05-2250肺炎克雷伯菌同時(shí)含有以下4種基因：qnrB、qnrS、CTX-M-14和DHA-1基因。質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)獲得含單qnrB基因接合子以及同時(shí)含qnrB和qnrS基因接合子；通過電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)獲得單含qnrS基因接合子。環(huán)丙沙星Etest結(jié)果顯示供體菌05-2250肺炎克雷伯菌、單含qnrB接合子、單含qnrS接合子、同時(shí)含qnrB和qnr

12、S接合子以及接合子E.coli J53的MIC分別為0.75μg/mL、0.094μg/mL、0.38μg/mL、0.25μg/mL、0.012μg/mL。接合子的環(huán)丙沙星MIC是受體菌E.coli J53環(huán)丙沙星MIC的8～32倍。質(zhì)粒抽提結(jié)果顯示05-2250肺炎克雷伯菌共有4條質(zhì)粒DNA條帶，質(zhì)粒大小依次為180kb、40kb、6kb、4kb。以質(zhì)粒DNA為模板，PCR檢測qnrB、qnrS、CTX-M-14和DHA-1基因結(jié)果顯