耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因及分子診斷研究.pdf

1、近年來，隨著臨床上碳青霉烯類抗生素的應(yīng)用越來越廣泛，在抗生素的選擇壓力下，對碳青霉烯類抗生素耐藥的細(xì)菌逐年增多。耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌引起醫(yī)院感染的報(bào)道呈全球性增加。鮑曼不動(dòng)桿菌生存能力和黏附能力強(qiáng)，廣泛存在醫(yī)院環(huán)境中，易定植在患者身體和醫(yī)院的醫(yī)療器械上且能存活時(shí)間較長。耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌，對幾乎所有的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素耐藥，能引起免疫低下患者的感染率和病死率增高，已經(jīng)引起了全世界的矚目。耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類抗生素主

2、要機(jī)制是產(chǎn)苯唑西林酶和產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶。整合子和插入序列共同區(qū)(insertion sequence common region，ISCR)廣泛存在于細(xì)菌基因組，整合子特異性捕獲外源性的耐藥基因盒并整合在自身基因組上而獲得耐藥性，ISCR可以通過滾環(huán)復(fù)制的方式任意移動(dòng)相近的DNA片段，為細(xì)菌耐藥性的傳播擴(kuò)散提供高效的媒介。
　　人的腸道是各種耐藥細(xì)菌及耐藥基因儲(chǔ)存的場所及臨床感染來源，耐藥細(xì)菌及耐藥基因可以隨糞便排出污染周圍環(huán)境

3、等進(jìn)行傳播擴(kuò)散。鮑曼不動(dòng)桿菌的最主要傳播方式是接觸傳播，在醫(yī)院內(nèi)范圍內(nèi)，消毒不徹底的醫(yī)療器械和醫(yī)務(wù)人員的手是最常見的傳播媒介。
　　目的：
　　本研究選取本院耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌分離率最高的科室，對患者臨床感染樣本及患者入院當(dāng)天糞便標(biāo)本分離的耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行耐藥基因及分子流行病學(xué)研究。對常見的碳青霉烯酶基因及耐藥基因轉(zhuǎn)移元件如整合子和ISCR進(jìn)行檢測，并進(jìn)一步檢測并通過進(jìn)行同源性分析確定整合子和ISCR所攜帶的耐

4、藥基因盒，隨后進(jìn)行ERIC-PCR及聚類分析研究克隆相關(guān)性。將碳青霉烯酶基因及耐藥基因轉(zhuǎn)移元件的檢測結(jié)果、ERIC-PCR及聚類分析結(jié)果、與患者的臨床資料結(jié)合起來，進(jìn)行綜合分析，對判斷耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者是散發(fā)還是暴發(fā)/流行，糞便中耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌是否為臨床感染來源意義重大。針對給臨床治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)的耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌，本研究建立了一種能夠快速、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)完成檢測的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法。
　　方法：<

5、br>　　1.臨床感染標(biāo)本耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌分離株的收集收集2014年7月～12月神經(jīng)外科、呼吸內(nèi)科、血液科送檢的各類臨床感染標(biāo)本中分離的耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌，對亞胺培南和美羅培南及其他臨床常用抗生素均耐藥，除對多粘菌素和（或）替加環(huán)素敏感，藥敏試驗(yàn)參考CLSI的標(biāo)準(zhǔn)。BD Phoenix100鑒定為醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體的菌株，PCR檢測鮑曼不動(dòng)桿菌特異基因。對所有菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)種、保存并提取細(xì)菌全基因組DNA。
　　2.

6、患者糞便中耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)2014年7月～12月對神經(jīng)外科、呼吸內(nèi)科、血液科各收集600個(gè)患者入院當(dāng)天糞便常規(guī)檢查剩余標(biāo)本，用麥康凱培養(yǎng)基（含2mg/L的美羅培南）篩選耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌。對所有菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)種、保存并提取細(xì)菌全基因組DNA。PCR檢測鮑曼不動(dòng)桿菌特異基因，利用BD phoenix100全自動(dòng)微生物鑒定儀器對鮑曼不動(dòng)桿菌特異基因陽性的菌株進(jìn)行確證和MIC藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)參考CLSI的標(biāo)準(zhǔn)。

7、>　　3.檢測常見碳青霉烯酶基因 PCR檢測臨床感染標(biāo)本及糞便標(biāo)本中分離的耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿的常見碳青霉烯酶基因blaNDM、 blaVIM、blaIMP、blaOXA-23-like、 blaOXA-24-like、 bla OXA-51-like和blaOXA-58-like，將陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，進(jìn)一步確定其亞型。
　　4.Ⅰ類整合子及其基因盒檢測檢測Ⅰ類整合酶基因，篩選出攜帶Ⅰ類整合子的細(xì)菌，再進(jìn)一步擴(kuò)增其可變區(qū)。對

8、可變區(qū)陽性的標(biāo)本，根據(jù)限制性內(nèi)切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切圖譜進(jìn)行分類，挑取不同譜型的標(biāo)本進(jìn)行測序，通過分析序列的同源性，得出對應(yīng)可變區(qū)的耐藥基因盒排列類型。
　　5.ISCR及其基因盒檢測檢測ISCR1基因，篩選出攜帶ISCR1基因的細(xì)菌，再進(jìn)一步擴(kuò)增其可變區(qū)。對可變區(qū)陽性標(biāo)本，根據(jù)限制性內(nèi)切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切圖譜進(jìn)行分類，挑取不同譜型的標(biāo)本進(jìn)行測序，通過分析序列的同源性，得出對應(yīng)可變區(qū)的耐藥基因盒排列類型。
　　

9、6.ERIC-PCR對于所有菌株進(jìn)行ERIC-PCR基因分型及電泳圖譜聚類分析，研究其克隆相關(guān)性。
　　7.耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立設(shè)計(jì)2組引物，1組分別特異擴(kuò)增不動(dòng)桿菌屬recA基因、鮑曼不動(dòng)桿菌16S-23S rRNA間隔區(qū)（intergenic spacer，ITS）基因和blaNDM基因，另1組分別特異擴(kuò)增blaOXA-23-like、 blaOXA-24-like、 blaOXA-51-li

10、ke和blaOXA-58-like基因，要求擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值相差大于1.5℃以便于準(zhǔn)確區(qū)分不同基因，對所有引物及其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行同源性比對，均未見除目的基因外的其他同源序列。以本實(shí)驗(yàn)室前期保存的，經(jīng)過普通PCR及測序驗(yàn)證含有目的基因的臨床菌株為陽性對照，建立多重實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)合熔解曲線分析的方法檢測耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌。利用單重實(shí)時(shí)熒光PCR分別對7個(gè)目的基因進(jìn)行特異性檢測，在特定的引物下同時(shí)對靶核酸序列和非靶核酸序列及滅菌去離子水進(jìn)行

11、PCR擴(kuò)增，進(jìn)行特異性評價(jià)。陽性對照菌株構(gòu)建重組質(zhì)粒以后，提取重組質(zhì)粒DNA定量后進(jìn)行一系列10倍稀釋，使最終于反應(yīng)管中的DNA含量依次相當(dāng)于106、105、104、103、102、10 copies/μl。反應(yīng)體系的敏感性評價(jià)則用上述濃度的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行。分別選用7個(gè)目的基因104 copies/μl重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)。分析整理批內(nèi)、批間的Ct值，對反應(yīng)體系的重復(fù)性及穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)。利用400株臨床分離的耐碳青霉

12、烯不動(dòng)桿菌（228株鮑曼不動(dòng)桿菌，178株非鮑曼不動(dòng)桿菌）進(jìn)行反應(yīng)體系的臨床菌株檢測評價(jià)。以普通PCR及電泳作為評價(jià)該反應(yīng)體系的方法對照。將含已知目的基因的耐碳青霉烯不動(dòng)桿菌菌株調(diào)制生理鹽水混懸液，包括101-108cfu/ml系列濃度，分別取200μl加入1.8ml糞便或痰液中制備模擬標(biāo)本，磁珠法提取模擬標(biāo)本的DNA，探討本研究建立的多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法用于直接檢測臨床感染標(biāo)本中耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌應(yīng)用前景。
　　結(jié)果：

13、
　　1.臨床感染標(biāo)本耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌分離株的收集參照BDPhoenix100鑒定及藥敏結(jié)果，結(jié)合PCR檢測鮑曼不動(dòng)桿菌特異基因Ab16S-23SrRNA ITS的結(jié)果，臨床感染樣本共分離出76株耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌，其中神經(jīng)外科35株、呼吸內(nèi)科20株、血液科21株。
　　2.糞便標(biāo)本耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)的分離鑒定從1800份糞便標(biāo)本中共篩查到140株耐碳青霉烯細(xì)菌，結(jié)合PCR檢測鮑曼不動(dòng)桿菌特異基因Ab16S-23S

14、rRNA ITS的結(jié)果，有20株為鮑曼不動(dòng)桿菌。其中神經(jīng)外科6株、呼吸內(nèi)科9株、血液科5株。
　　3.碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果常見碳青霉烯酶基因blaNDM、 blaVIM、blaIMP、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、bla OXA-51-like和blaOXA-58-like檢出率分別為4.1％、22.9％、26.0％、67.7％、63.5％、46.8％、65.6％。
　　結(jié)論：
　　1.

15、本研究對96株耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌檢測常見碳青霉烯酶基因，其中OXA酶的blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like和blaOXA-58-like基因均具有較高的攜帶率，表明產(chǎn)OXA酶是耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類抗生素的最重要機(jī)制。
　　2.本研究中Ⅰ類整合子可變區(qū)檢出12種不同類型的基因盒排列類型，攜帶21種不同類型耐藥基因，主要包括氨基糖苷類耐藥基因、氯霉素耐藥基因、甲氧芐

16、啶耐藥基因、β-內(nèi)酰胺酶基因。其中，catB3--qnrV C-like--aacA4和aacA4--blaIMP-1--blaOXA-30--catB3耐藥基因盒排列組合為首次在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)。
　　3.本研究中ISCR1可變區(qū)檢出6種不同類型的基因盒排列類型，檢出攜帶11種不同類型耐藥基因，主要包括β-內(nèi)酰胺酶基因和喹諾酮類耐藥基因。
　　4.本研究中耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌Ⅰ類整合子和ISCR1的攜帶率均較高，Ⅰ類整

17、合子可變區(qū)及ISCR1可變區(qū)分別攜帶21種和11種不同類型耐藥基因，相應(yīng)的耐藥基因覆蓋了臨床常用種類抗生素，表明Ⅰ類整合子和ISCR1在介導(dǎo)多重耐藥及耐藥基因的水平傳播中具有重要作用。
　　5.ERIC-PCR基因分型及聚類分析，結(jié)合耐藥基因研究結(jié)果可用于闡明耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌感染是散發(fā)還是暴發(fā)/流行。
　　6.成功的建立了一種快速檢測耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，能對攜帶blaNDM、 blaOXA-