耐碳青霉烯G-桿菌碳青霉烯酶基因、整合子和ISCR1結(jié)構(gòu)特征及基因分型研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 近年來(lái)由于抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌在抗生素的選擇壓力下耐藥率不斷提高，耐碳青霉烯G-桿菌的分離率也逐年升高。耐碳青霉烯細(xì)菌是對(duì)亞胺培南或者美洛培南抗菌藥物耐藥的細(xì)菌。革蘭陰性(G-)桿菌是引起臨床感染最常見(jiàn)的細(xì)菌，主要包括腸桿菌科（常見(jiàn)大腸埃希菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬）和非發(fā)酵革蘭陰性桿菌（常見(jiàn)銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌屬）。細(xì)菌對(duì)碳青霉烯耐藥性不斷上升和快速傳播已成為臨床感染治療面臨的重要難題，其耐藥機(jī)制研究

2、已成為微生物領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐碳青霉烯的機(jī)制有很多種，其中耐藥基因水平轉(zhuǎn)移是細(xì)菌耐藥性迅速產(chǎn)生及擴(kuò)散的主要原因之一。耐藥基因位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子或插入序列共同區(qū)(ISCR)等可水平轉(zhuǎn)移的基因元件上，通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座等方式在不同菌株間水平傳播。研究臨床G-桿菌泛耐藥菌的耐藥機(jī)制，可以指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，為新型抗生素的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)，為預(yù)防傳播提供依據(jù)。目前國(guó)內(nèi)外可水平轉(zhuǎn)移的耐藥基因元件的研究

3、，主要集中在可水平轉(zhuǎn)移的碳青霉烯酶基因家族、可攜帶多種耐藥基因盒的整合子、可攜帶多種耐藥基因盒且傳播能力更強(qiáng)的插入序列共同區(qū)(ISCR1)的研究。
　　 碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少亞胺培南或美羅培南的一類(lèi)β內(nèi)酰胺酶，包括Ambler分子結(jié)構(gòu)分類(lèi)的A、B、D三類(lèi)酶。其中B類(lèi)為金屬β內(nèi)酰胺酶，簡(jiǎn)稱金屬酶，屬于Bush分類(lèi)中的第3組，按來(lái)源可分為天然金屬酶和獲得性金屬酶，前者由染色體編碼，后者多由質(zhì)粒編碼，主要見(jiàn)于銅綠假單胞菌、不

4、動(dòng)桿菌屬和腸桿菌科細(xì)菌。A、D類(lèi)為絲氨酸酶，分別屬于Bush分類(lèi)中的第2f和2d亞組，A類(lèi)酶主要見(jiàn)于腸桿菌科細(xì)菌，D類(lèi)酶（OXA型酶）主要見(jiàn)于不動(dòng)桿菌屬。由產(chǎn)碳青霉烯酶菌株感染造成的暴發(fā)流行，有時(shí)使治療陷入無(wú)藥可用的境地，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大地挑戰(zhàn)。以往一直以耐碳青霉烯類(lèi)抗生素非發(fā)酵革蘭陰性桿菌感染的報(bào)道為主，近幾年世界各地均報(bào)道出現(xiàn)耐碳青霉烯抗生素的腸桿菌科細(xì)菌，尤其在腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)攜帶新德里Ⅰ型金屬β內(nèi)酰胺酶(NDM-1)、

5、KPC的菌株而備受關(guān)注。
　　 整合子可通過(guò)對(duì)基因盒的捕獲和剪切使基因盒發(fā)生移動(dòng)，自身可位于轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等可移動(dòng)基因元件上使整合子發(fā)生移動(dòng)。整合子是細(xì)菌特別是革蘭陰性菌基因中，一種能識(shí)別且俘獲移動(dòng)性基因盒，并有位點(diǎn)特異性的重組表達(dá)系統(tǒng)。整合子本身無(wú)法移動(dòng)，但常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)座子、接合性質(zhì)粒、噬菌體或細(xì)菌染色體上，共同做為自身移動(dòng)的載體，捕獲和整合耐藥基因，形成巨大的多基因座，并隨細(xì)菌的繁殖復(fù)制到子代DNA中。典型的整合子結(jié)構(gòu)由3部分組

6、成:5’保守區(qū)(5'conserved segment,5'CS)、3'保守區(qū)(3'conserved segment，3'CS)和兩者之間的可變區(qū)(variable region)。整合子5'保守區(qū)包括編碼整合酶(integrase，IntI)的基因(intI)、整合子重組位點(diǎn)attI和整合子可變區(qū)啟動(dòng)子(Pant)。其中Pant位于IntI1的編碼框內(nèi)，有的整合子還有啟動(dòng)子P2。整合子常根據(jù)intI基因序列進(jìn)行分類(lèi)，目前已被分為10

7、類(lèi)，1類(lèi)整合子最常見(jiàn)，從臨床菌株中發(fā)現(xiàn)的整合子大多屬于此類(lèi)。整合子可變區(qū)帶有不同數(shù)量的基因盒，大部分是編碼各種抗生素抗性的耐藥基因盒。1類(lèi)整合子的3'保守區(qū)包括3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF):磺胺耐藥基因(sul1)，季銨鹽化合物及溴乙錠的耐受基因(qacE△1)及功能不明的ORF5。
　　 ISCR是由“insertion sequences”(ISs)和“commmon regions”(CRs)得來(lái)。它既可具有插入序列的特點(diǎn)，也

8、具有共同區(qū)的特點(diǎn)。IS屬于高度可移動(dòng)性轉(zhuǎn)座因子，對(duì)基因組一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)具有插入能力的小分子片段，并常可以移動(dòng)鄰近的基因。ISCR是一類(lèi)IS91-1ike因子家族的成員，缺少反向重復(fù)序列，通過(guò)滾環(huán)方式轉(zhuǎn)移鄰近的耐藥基因。ISCR成員中ISCR1研究最為廣泛，它常出現(xiàn)在復(fù)雜性Ⅰ類(lèi)整合子。ISCR1介導(dǎo)一系列的轉(zhuǎn)座事件發(fā)生，轉(zhuǎn)座不同長(zhǎng)度的耐藥基因，如catA2、dfrA、qnr、blaCTX-M、blaCMY。ISCR1常連同耐藥基因插入到

9、普通的一類(lèi)整合子的3'保守末端，介導(dǎo)形成復(fù)雜的一類(lèi)整合子，如In6和In7。另外，環(huán)狀形式的ISCR1因子連同耐藥基因直接插入到帶有一個(gè)ISCR1拷貝的整合子3'保守末端，介導(dǎo)形成帶有兩個(gè)拷貝ISCR1因子的復(fù)雜的整合子，這些會(huì)導(dǎo)致菌株的耐藥播散性更強(qiáng)。
　　 目前耐碳青霉烯G-桿菌的傳播機(jī)制研究也越來(lái)越受到關(guān)注，對(duì)醫(yī)院各科室各類(lèi)標(biāo)本分離細(xì)菌種類(lèi)及耐藥性進(jìn)行分析，可利用世界衛(wèi)生組織網(wǎng)站免費(fèi)提供的WHONET軟件分析，如發(fā)現(xiàn)泛耐藥

10、G-桿菌的暴發(fā)或流行，則需及時(shí)進(jìn)行傳播機(jī)制等流行病學(xué)研究。首先進(jìn)行個(gè)案調(diào)查，查閱病案等資料。再收集保存患者及可能傳播來(lái)源分離的菌株，進(jìn)行基因分型等分子流行病學(xué)研究。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的基因分型方法主要包括脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法(PFGE)、隨機(jī)引物PCR分型(ERIC-PCR)、多位點(diǎn)基因測(cè)序分型(MLST)。如果主要用于調(diào)查某次暴發(fā)或流行，則可選用PFGE和ERIC-PCR，如果主要用于與國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行比較，則最好選用ML

11、ST。
　　 本課題針對(duì)臨床分離的耐碳青霉烯G-桿菌進(jìn)行常見(jiàn)碳青霉烯酶基因檢測(cè)，重點(diǎn)對(duì)NDM、KPC基因陽(yáng)性菌株進(jìn)行分析;對(duì)臨床分離的耐碳青霉烯銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌屬進(jìn)行Ⅰ類(lèi)整合子和ISCR1相關(guān)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，從而了解Ⅰ類(lèi)整合子和ISCR1的攜帶耐藥基因的分布特征;對(duì)臨床分離的銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌屬，建立ERIC-PCR基因分型方法，進(jìn)行分子流行病學(xué)研究。已經(jīng)針對(duì)攜帶KPC基因的超級(jí)細(xì)菌建立了多位點(diǎn)基因序列分型(MLST

12、)方法，闡明這些菌株的分子遺傳學(xué)特征。
　　 研究方法:
　　 1.菌株的選取和基因組DNA提取收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室2009年6月至2011年6月臨床分離的耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的腸桿菌科、不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌，主要分離自痰液、尿液、分泌物、血液等各類(lèi)標(biāo)本。用SDS裂解，蛋白酶K消化，酚-氯仿提取，醋酸鈉-乙醇沉淀的方法提取細(xì)菌的全基因組DNA。
　　 2.碳青霉烯酶基因檢測(cè)及水平傳播機(jī)制研究聚合

13、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)常見(jiàn)碳青霉烯酶基因(NDM、KPC、VIM、IMP、SPM、GIM、OXA)，對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定以確定基因亞型，并重點(diǎn)對(duì)攜帶NDM或KPC的陽(yáng)性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增核糖體基因及間隔區(qū)序列并測(cè)序，以保證屬種鑒定的準(zhǔn)確，對(duì)攜帶NDM或KPC的陽(yáng)性菌株做接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)檢測(cè)NDM、KPC耐藥基因是否位于接合性質(zhì)粒上及對(duì)耐藥表型的影響。
　　 3.Ⅰ類(lèi)整合子、ISCR1及復(fù)雜性整合子結(jié)構(gòu)研究分別擴(kuò)增Ⅰ類(lèi)整合子IS

14、CR1保守區(qū)和可變區(qū)，然后利用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ和RsaⅠ酶切可變區(qū)，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行初步分類(lèi)，挑選酶切不同類(lèi)型測(cè)序，分析同源性和耐藥基因盒組合。對(duì)同時(shí)攜帶整合子和ISCR1的菌株擴(kuò)增其串聯(lián)區(qū)，通過(guò)測(cè)序得到復(fù)雜性整合子結(jié)構(gòu)。
　　 4.基因分型研究針對(duì)攜帶KPC基因的超級(jí)細(xì)菌進(jìn)行了多位點(diǎn)基因序列分型(MLST)，對(duì)臨床分離的耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌屬，建立ERIC-PCR基因分型方法，進(jìn)行分子流行病學(xué)研究。<

15、br>　　 研究結(jié)果:
　　 1.碳青霉烯酶基因的檢出情況共檢出9株肺炎克雷伯菌、159株銅綠假單胞菌、201株不動(dòng)桿菌屬對(duì)亞胺培南或美洛培南耐藥的菌株。273株菌檢測(cè)出攜帶碳青霉烯酶基因:1株不動(dòng)桿菌屬genomosp.3種、1株13TU種攜帶金屬酶NDM-1基因（國(guó)際首次）,9株肺炎克雷伯菌攜帶KPC-2型碳青霉烯酶基因，31株銅綠假單胞菌攜帶IMP-1基因，15株銅綠假單胞菌攜帶IMP-9基因，1株銅綠假單胞菌攜帶IMP

16、-25基因，16株銅綠假單胞菌攜帶VIM-2基因，180株不動(dòng)桿菌攜帶OXA-23基因，148株不動(dòng)桿菌攜帶OXA-51基因，其中135株同時(shí)攜帶OXA-23和OXA-51基因，8株不動(dòng)桿菌攜帶OXA-58基因。其中NDM和KPC基因均位于接合性質(zhì)粒上。
　　 2.檢測(cè)到239株細(xì)菌攜帶Ⅰ類(lèi)整合酶，165株細(xì)菌攜帶基因盒9株肺炎克雷伯菌均攜帶dfrA25;在201株不動(dòng)桿菌中，115株aacA4+catB8+aadA1,4株aa

17、cC1+orfP+orfQ+aadA1,2株arr3+aacA4,;在240株銅綠假單胞菌中，15株blaIMP-9+aacA4+blaOXA-10+aadA2,7株aac(6')-Ⅱ+aadA13+cmlA8+blaOXA-10a,6株aadB+blaPSE-1,3株aacA4+blaIMP+ blaOXA-30+catB3,2株dfrA12+orfF+aadA2，1株aadA2+aacA4，1株攜帶aadB+aadA2;dfrA15

18、兩個(gè)整合子。
　　 3.檢測(cè)到121株細(xì)菌ISCR1保守區(qū)陽(yáng)性，23株ISCR1可變區(qū)陽(yáng)性9株肺炎克雷伯菌中ISCR1均為陰性。在201不動(dòng)桿菌屬中，102株orf513陽(yáng)性，其中69株ISCR1+qnrA1+ampR+qacE△1,21株ISCR1+blaPER-1+GST+ABCtransporter+qacE△1;在159株銅綠假單胞菌中，19株orf513陽(yáng)性，2株ISCR1+qnrA1+ampR+ qacE△1。

19、>　　 4.復(fù)雜性整合子結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)在同一株銅綠假單胞菌中同時(shí)攜帶兩個(gè)復(fù)雜性整合子，結(jié)構(gòu)分別為:intI1+dfrA15+qacdelsul+ISCR1+qnrA1+ampR+qacdelsul;intI1+aadB+aadA2+qacdelsul+ISCR1+qnrA1+ampR+qacdelsul。
　　 5.ERIC-PCR結(jié)果顯示:本院2009年6月-2011年6月分離的耐碳青霉烯銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌均為散發(fā)，不動(dòng)桿

20、菌有優(yōu)勢(shì)克隆株。9株肺炎克雷伯菌株MLST分型均為ST11。
　　 結(jié)論:
　　 1.國(guó)際首次在不動(dòng)桿菌屬genomosp.3種、13TU種發(fā)現(xiàn)金屬酶NDM-1基因（均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證），且均位于接合性質(zhì)粒上。在9株耐碳青霉烯抗生素的肺炎型肺炎克雷伯菌株中，檢測(cè)到9株均攜帶KPC-2基因，均位于接合性質(zhì)粒上，說(shuō)明本院的肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯主要是由KPC-2基因引起的。耐碳青霉烯抗生素的不動(dòng)桿菌屬主要是由攜帶OXA基因引起的。

21、銅綠假單胞菌耐碳青霉烯的部分原因是由于攜帶IMP基因或者VIM基因。
　　 2.本院臨床分離的泛耐藥G-桿菌Ⅰ類(lèi)整合酶的攜帶率為64.8％，基因盒的攜帶率為41.5％，耐藥基因主要是耐氨基糖苷類(lèi)、甲氧芐啶類(lèi)、氯霉素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)。
　　 3.本院臨床分離的泛耐藥G-桿菌ISCR1轉(zhuǎn)座酶的攜帶率為32.8％，在ISCR1陽(yáng)性菌株中，ISCR1攜帶耐藥基因比例為19.0％。攜帶的耐藥基因主要是qnrA1。