大腸桿菌趨化信號網(wǎng)絡(luò)及適應(yīng)行為的研究.pdf

1、生物是自然界的重要組成部分。雖然，不同的生物擁有不同的結(jié)構(gòu)性狀和功能，但其組成生命的基本單元卻是相同的。因此，從某種意義上來說，它們或許有著相似甚至相同的基本規(guī)律。遵循著科學(xué)研究的基本發(fā)展模式，我們選取了結(jié)構(gòu)較為簡單的單細(xì)胞原核細(xì)菌——大腸桿菌作為研究對象。大腸桿菌結(jié)構(gòu)簡單，易于獲取，培養(yǎng)方便，繁殖迅速等特點(diǎn)是其備受科研工作者喜愛的原因。不同于物體在宏觀尺度的行為，只有微米量級尺寸的大腸桿菌就像一個精細(xì)的小機(jī)器，它在微米的尺度完成生物的

2、一些基本功能，如趨化適應(yīng)等。
　　本論文先后使用乳膠小球標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移等技術(shù)手段，分別觀察和記錄了大腸桿菌鞭毛馬達(dá)和內(nèi)部趨化信號蛋白輸出的適應(yīng)信號。使用信號處理的基本方法，運(yùn)用簡單的數(shù)學(xué)物理模型，解釋各種條件導(dǎo)致的適應(yīng)信號差異。并結(jié)合實(shí)驗(yàn)與模擬，闡述了信號差異對大腸桿菌趨化行為的影響。下面，我們簡單介紹下各章所述的主要內(nèi)容。
　　論文的緒論部分主要介紹了大腸桿菌的基本情況及其相關(guān)的研究進(jìn)展。我們從大腸桿菌的形態(tài)與結(jié)構(gòu)

3、說起，依次介紹了其遺傳增殖和致病性情況。重點(diǎn)介紹了大腸桿菌研究的兩大重點(diǎn)內(nèi)容——運(yùn)動性和趨化性。對于運(yùn)動性的說明，我們首先介紹了各個運(yùn)動部件的結(jié)構(gòu)與組成，包括嵌入細(xì)胞三層壁的鞭毛馬達(dá)，作為傳動部件的鞭毛鉤以及運(yùn)動的終端輸出鞭毛絲。其中，最為主要的是運(yùn)動的源頭——鞭毛馬達(dá)。其次，我們簡要地說明了單個大腸桿菌在液體環(huán)境下的游動行為以及大量菌體在凝膠表面的群集運(yùn)動行為，并簡單介紹了大腸桿菌群集運(yùn)動的結(jié)果——生物膜的形成。而對于大腸桿菌的趨化性

4、介紹，我們首先從大腸桿菌的受體開始介紹，完整地描述了趨化信號網(wǎng)絡(luò)通路。緊接著概述了大腸桿菌趨化網(wǎng)絡(luò)和鞭毛馬達(dá)的MWC和伊辛這兩種主流模型。緒論部分的最后，我們概括地闡述了本論文研究的意義及主要內(nèi)容。
　　論文的第二章主要是實(shí)驗(yàn)方法簡單介紹。該章的起始，我們首先簡要地介紹了各種試劑的配置方法及用途。緊接著我們將改造菌種時所用的DNA重組方法進(jìn)行簡短的原理與步驟說明。其中，主要包括熱擊法轉(zhuǎn)化，電穿孔轉(zhuǎn)化，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及λ噬菌體Re

5、d重組系統(tǒng)基因刪除。
　　論文的第三章主要是探究生長條件對大腸桿菌趨化行為的影響。我們分別測量了營養(yǎng)貧乏與豐富的兩種培養(yǎng)液（H1和TB）下生長的大腸桿菌的生長曲線，選擇合適的采樣區(qū)間。比較了兩種細(xì)菌的CW bias分布，無刺激環(huán)境下的馬達(dá)關(guān)聯(lián)時間，50μM MeAsp的響應(yīng)恢復(fù)時間以及毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)的聚集情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)菌的CW bias分布基本相同，關(guān)聯(lián)時間和恢復(fù)時間均表現(xiàn)出較大的差別。生長于H1溶液中的細(xì)菌表現(xiàn)出更短的關(guān)聯(lián)時

6、間與恢復(fù)時間，分別是TB細(xì)菌1.65和1.36倍。最后，我們分別通過毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)和數(shù)值模擬證明了在H1中生長的大腸桿菌對于刺激濃度具有更強(qiáng)的局域行為，能更快的響應(yīng)濃度變化，完成趨化。
　　論文的第四章主要是探究受體協(xié)同作用對其趨化行為的影響。我們使用小球標(biāo)記和FRET技術(shù)，先后測量了單種受體菌株和野生型菌株的臺階響應(yīng)信號，劑量響應(yīng)曲線。并且，改變Tar和Tsr受體比例觀察其臺階響應(yīng)的差別。最后，利用簡單的swim plate實(shí)驗(yàn)比較

7、了兩種細(xì)菌的趨化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MeAsp濃度為5μM至250μM時，單種受體菌株表現(xiàn)出明顯的不完全適應(yīng)行為，而野生型菌株則幾乎可以完成精確適應(yīng)。在比較適應(yīng)穩(wěn)態(tài)活性和適應(yīng)時間時，我們發(fā)現(xiàn)單種受體的適應(yīng)活性與適應(yīng)時間隨刺激濃度的變化明顯，而野生型菌株的變化相對小得多。我們在比較兩種細(xì)菌的劑量響應(yīng)曲線后，得到單種受體菌株的MWC簇中總受體數(shù)約為11.7，而野生型則為19.5。我們通過模擬得到單種受體細(xì)菌的甲基化速率約為野生型的0.56倍，

8、這應(yīng)該與受體簇的差別有關(guān)。除此之外，我們還研究了受體比例對過沖行為的影響。最后，通過swim plate實(shí)驗(yàn)證實(shí)了單種受體細(xì)菌趨化能力更差。
　　論文的第五章主要是對鞭毛馬達(dá)適應(yīng)性重組進(jìn)行建模。細(xì)菌趨化是研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的典型系統(tǒng)。其最具代表性的特點(diǎn)就是適應(yīng)行為的魯棒性。但是，這樣一個系統(tǒng)的適應(yīng)過程究竟有多快仍具有爭議性。從細(xì)胞內(nèi)酶活性測量結(jié)果來看，適應(yīng)時間大約有幾十秒;而從鞭毛馬達(dá)的水平進(jìn)行測量的結(jié)果卻不足十秒。最近的研究表明，鞭毛

9、馬達(dá)展現(xiàn)出適應(yīng)性的重組，其主要生理作用是在受體的輸出與馬達(dá)的輸入之間提供一種強(qiáng)力的匹配。普遍認(rèn)為其適應(yīng)非常緩慢，以致于無法為整個趨化系統(tǒng)的適應(yīng)提供較為明顯的貢獻(xiàn)。本文通過對馬達(dá)適應(yīng)性重組的理論建模和實(shí)驗(yàn)測量，說明由馬達(dá)適應(yīng)導(dǎo)致的部分適應(yīng)能夠顯著地加快系統(tǒng)的適應(yīng)，從而解決了之前關(guān)于適應(yīng)時間的爭議。
　　論文的第六章主要是對三項(xiàng)核心工作的總結(jié)與展望。第一項(xiàng)工作主要是結(jié)合小球標(biāo)記馬達(dá)等實(shí)驗(yàn)與計算機(jī)模擬得出生長于H1中的大腸桿菌具有更強(qiáng)的