工程大腸桿菌制備甲羥戊酸的研究.pdf

1、甲羥戊酸（MVA）是異戊烯焦磷酸（IPP）合成的關(guān)鍵性前體物質(zhì)，而萜類化合物又由 IPP經(jīng)催化合成，所以MVA可以通過MVA途徑間接合成各種類異戊二烯化合物，并廣泛應(yīng)用于食品，醫(yī)藥和化工行業(yè)，且市場需求旺盛。由于傳統(tǒng)方法原料難得，能耗高，對環(huán)境污染大，且不能合成天然型的甲羥戊酸內(nèi)酯（MVAL），并不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。生物法合成MVA可利用生物質(zhì)降解得到的葡萄糖及工業(yè)廢水中的乙酸等為原料，具有資源可持續(xù)及綠色環(huán)保的優(yōu)勢，成為目前的研究熱

2、點。本研究選擇工業(yè)微生物常用菌株 Escherichia coli作為生物催化劑，建立了以葡萄糖、乙酸等為底物，生物合成MVA的合成體系。
　　本研究首先以重組大腸桿菌YJM16為供試菌株，進行5L發(fā)酵罐勻速補料的高密度發(fā)酵實驗，最終細胞產(chǎn)量達到54.48g·L-1，MVA產(chǎn)量達到40.43g·L-1，產(chǎn)率為20.2％。然后根據(jù)Logistic方程、Luedeking-Piret方程和類似Luedeking-Piret方程，擬合出

3、重組大腸桿菌高密度發(fā)酵過程中菌體生長、MVA合成、基質(zhì)消耗的動力學(xué)模型及模型參數(shù)。結(jié)果表明，MVA的合成與重組大腸桿菌的生長速率及菌體積累量均有關(guān)。菌體生長模型、底物消耗模型和產(chǎn)物生成模型擬合度R2分別達到了0.9319、0.9578和0.9751，可用于描述利用重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)MVA的過程。
　　過量表達acs，maeB，sfcA，yfcC，pckA和ppsA六種基因及共表達acs和maeB，sfcA，yfcC，pck

4、A及ppsA五種基因，構(gòu)建出利用乙酸為碳源的重組菌株，進行搖瓶篩選，選出最優(yōu)菌株；經(jīng)搖瓶篩選發(fā)現(xiàn)，過量表達乙酰輔酶A合成酶ACS利于乙酸的分解利用，過量表達蘋果酸酶SFCA和MAEB提供還原力，過量表達利用乙酸的糖異生關(guān)鍵酶PCKA和PPSA及局部調(diào)控因子YFCC，對乙酸利用及產(chǎn)物合成均沒有明顯作用，說明胞內(nèi)還原力及糖異生途徑并不是影響產(chǎn)物合成的關(guān)鍵因素。利用乙酸的最優(yōu)菌株為表達acs的菌株FHR-2：產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為368mg·L-1

5、和6.9%，較原始菌株分別提高了31.4%和1.47%。
　　最后放大到5L發(fā)酵罐水平進行驗證，首次利用乙酸為碳源，獲得MVA，并對初碳源的種類及溶氧條件進行優(yōu)化，得出最優(yōu)發(fā)酵條件：碳源為20g·L-1葡萄糖，溶氧控制在20%，通過自動流加氨水，硫酸將 pH控制在7.0。培養(yǎng)溫度37℃至葡萄糖耗盡，OD600nm約為19，誘導(dǎo)前調(diào)整為32℃，添加IPTG（終濃度為0.5mM），誘導(dǎo)基因表達，持續(xù)發(fā)酵60h，補料為乙酸銨以4g·L-