亞抑制濃度慶大霉素對(duì)大腸桿菌適應(yīng)性改變的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　根據(jù)前期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌ATCC25922經(jīng)慶大霉素處理后表型的變化，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選差異基因，探討大腸桿菌在體外經(jīng)亞抑制濃度的慶大霉素短期預(yù)處理后，運(yùn)動(dòng)性被抑制的分子機(jī)制。觀察細(xì)菌再次接觸慶大霉素后發(fā)生適應(yīng)性耐藥的現(xiàn)象，構(gòu)建yhjX基因的敲除株和互補(bǔ)株，以期揭示大腸桿菌對(duì)慶大霉素發(fā)生適應(yīng)性耐藥的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：
　?、盼⒘咳鉁♂尫y(cè)慶大霉素對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）。⑵1/2 M

2、IC、1/4 MIC和1/8 MIC慶大霉素對(duì)大腸桿菌預(yù)處理1小時(shí)后測(cè)生長(zhǎng)曲線。⑶1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC慶大霉素對(duì)大腸桿菌預(yù)處理1小時(shí)后在半固體培養(yǎng)基上測(cè)定其游動(dòng)運(yùn)動(dòng)和涌動(dòng)運(yùn)動(dòng)。⑷轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較表達(dá)水平的差異，用Real-time PCR對(duì)基因sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、motA、motB、filF、fliG、fliM、fliN、yhjX進(jìn)行驗(yàn)證。⑸ELISA試劑盒測(cè)大腸桿菌菌體內(nèi)琥珀酸脫氫酶的濃度。

3、⑹酶標(biāo)儀法測(cè)大腸桿菌菌體內(nèi)延胡索酸的濃度。⑺在涌動(dòng)瓊脂平板里各添加0.9 mM、1.8 mM、3.6 mM的延胡索酸溶液和1 mM、2 mM、4 mM的丙二酸溶液，經(jīng)亞抑制濃度的慶大霉素對(duì)大腸桿菌預(yù)處理1小時(shí)后測(cè)涌動(dòng)運(yùn)動(dòng)。⑻微量肉湯稀釋法測(cè)慶大霉素對(duì)大腸桿菌的野生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株的MIC。⑼大腸桿菌的野生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株在含1 MIC和1/2 MIC慶大霉素的MH肉湯里測(cè)生長(zhǎng)曲線。⑽經(jīng)亞抑制濃度的慶大霉素誘導(dǎo)大腸桿菌的野

4、生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株1小時(shí)后，再接觸1 MIC和1/2 MIC慶大霉素，測(cè)生長(zhǎng)曲線和平板菌落計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：
　?、俅竽c桿菌的MIC為2μg/ml。②大腸桿菌在1/2 MIC慶大霉素與無慶大霉素預(yù)處理后生長(zhǎng)曲線基本一致。③與對(duì)照組相比，1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC慶大霉素預(yù)處理能夠顯著抑制大腸桿菌的涌動(dòng)運(yùn)動(dòng)，且慶大霉素的濃度越大抑制作用越大。然而慶大霉素對(duì)大腸桿菌的游動(dòng)運(yùn)動(dòng)無明顯作用。④與對(duì)照組相比

5、，測(cè)序結(jié)果顯示處理組基因sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、motA、motB、fliG的表達(dá)水平下調(diào)了，filF、fliM、fliN、yhjX的表達(dá)水平上調(diào)了。除了基因fliG，其余驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。⑤處理組的琥珀酸脫氫酶濃度比對(duì)照組顯著下降。⑥處理組的延胡索酸濃度比對(duì)照組顯著下降。⑦延胡索酸可以逆轉(zhuǎn)由慶大霉素引起抑制的涌動(dòng)運(yùn)動(dòng)，且延胡索酸的濃度越高逆轉(zhuǎn)的程度越大。而丙二酸可以加強(qiáng)由慶大霉素引起的涌動(dòng)運(yùn)動(dòng)抑制作用。

6、⑧大腸桿菌的的野生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株的MIC均為2μg/ml。⑨在1/2 MIC慶大霉素中，敲除菌株明顯比野生菌株和互補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)情況好。⑩在1/2 MIC慶大霉素中，野生和互補(bǔ)菌株會(huì)出現(xiàn)適應(yīng)性耐藥，而敲除菌株不會(huì)出現(xiàn)適應(yīng)性耐藥。
　　結(jié)論：
　?、艁喴种茲舛鹊膽c大霉素預(yù)處理可抑制大腸桿菌的涌動(dòng)運(yùn)動(dòng)，該作用可以認(rèn)為是慶大霉素的特殊抗生素后效應(yīng)之一。這種抑制作用是由琥珀酸脫氫酶sdh基因表達(dá)水平下調(diào)，繼而使大腸桿菌延胡索