大腸桿菌血清抗體與硫酸慶大霉素偶聯(lián)構建抗體靶向藥物的研究.pdf

1、近年來，治療腫瘤的抗體藥物研發(fā)取得了突破性的進展，抗體藥物成為生物技術藥物領域的熱點之一。腫瘤抗體靶向藥物主要是應用抗原抗體反應的原理構建腫瘤抗體藥物，將治療腫瘤的藥物與抗體結合，構建“生物導彈”，對腫瘤實施生物療法。而應用抗原抗體反應的原理構建抗菌藥物，將抗菌藥物與抗體結合，構建“生物導彈”，對病原菌實施“精確打擊”的研究，卻至今沒有報道。為構建針對大腸桿菌的靶向性硫酸慶大霉素，本文進行了如下研究： 1．大腸桿菌血清抗體與聚乙

2、二醇和硫酸慶大霉素復合物的制備 為了探討大腸桿菌抗血清能否與硫酸慶大霉素結合，以及結合后是否會影響硫酸慶大霉素的藥效和大腸桿菌血清抗體的生物學活性。本實驗首先采用豬大腸桿菌滅活油乳佐劑苗，多次多部位背部皮下注射健康家兔，心臟采血，采集超免血清，用ELISA方法對抗豬大腸桿菌血清進行檢測，其超免血清的抗體效價高達1：2048。然后對二者的結合條件進行摸索，以不同濃度的硫酸慶大霉素、免疫血清、PEG，建立方陣試驗。收集各試驗組血清抗

3、體與硫酸慶大霉素結合產(chǎn)生的沉淀物進行聚丙烯酰胺電泳、革蘭氏染色、電鏡觀察。結果發(fā)現(xiàn)，藥物與血清抗體結合良好，以硫酸慶大霉素800(mL)：免疫血清4(μg)：PEG18(g)的結合量最大。因此，血清抗體與硫酸慶大霉素的結合具備有效性和可行性。 2．大腸桿菌血清抗體與PEG6000和硫酸慶大霉素復合物結構研究 為了探討了結合物的結構，本實驗對結合物進行了紅外掃描和紫外吸收光譜測定，結果顯示：結合物是以PEG6000為中間媒

4、介。血清抗體與，硫酸慶大霉素先分別與PEG6000結合，從而形成血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素復合物。結合的方式是氫鍵。PEG6000主要與血清抗體的酰胺鍵結合。 3．大腸桿菌血清抗體與PEG6000和硫酸慶大霉素復合物的靶向性研究 為了探討結合物的靶向性，本實驗對結合物進行間接ELISA、熒光染色和免疫電鏡檢測。間接ELISA結果表明：二者的結合對抗體的生物學活性和免疫學功能不會產(chǎn)生抑制作用；熒光抗體染色結果表

5、明：硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結合物具有大腸桿菌特異靶向性。硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結合物與大腸桿菌菌液混合4min后，硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結合物能與大腸桿菌結合。硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結合物與大腸桿菌菌液混合7min后，硫酸慶大霉素、大腸桿菌血清抗體和PEG6000結合物能進入大腸桿菌菌體內(nèi)；由膠體金免疫電鏡結果中，在大腸桿菌的菌體內(nèi)外均可見到

6、膠體金顆粒，證明結合了藥物的抗體的仍能高效與大腸桿菌作用，有較強的靶向作用。 4.大腸桿菌血清抗體與PEG6000和硫酸慶大霉素復合物藥動學檢測及安全性評價 本實驗還探討了結合物在動物體內(nèi)的藥動學并對其進行了安全性檢測。結果表明：血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結合物在家兔體內(nèi)的生物半衰期t<,1/2>為4.83 h，藥-時曲線下面積AUC為191.41 h.μg/mL，硫酸慶大霉素結合物在家兔體內(nèi)的生物半衰期為t

7、<,1/2>1.03 h，AUC為63.42 h.μg/ml，這表明血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結合物藥代動力學及組織分布發(fā)生了明顯變化，藥物代謝速度大大減慢，有效血藥濃度時間延長，與脂質(zhì)體緩釋劑的特點相似。由于血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結合物毒性很低，對小鼠的最大耐受量大于750mg/kg.bw，此量相當于臨床用量的150倍。結果表血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結合物的毒性顯著低于硫酸慶大霉素，表明血清抗

8、體-PEG6000有降低藥物毒性的作用。血清抗體-PEG6000-硫酸慶大霉素結合物對小鼠重要臟器的生長發(fā)育無明顯影響。 5.大腸桿菌血清抗體與PEG6000和硫酸慶大霉素復合物的藥效學研究 為了研究結合物的藥效學，本實驗應用結合物進行了體外抗菌試驗、大腸桿菌病動物模型治療試驗。 體外抑菌試驗表明：靶向慶大霉素對大腸桿菌C<,44103>的最低抑菌濃度約為硫酸慶大霉素的1/10<'5>。靶向硫酸慶大霉素對大腸桿菌

9、C<,44103>的最低殺菌濃度約為硫酸慶大霉素的1/10<'4>。體外抑菌實驗說明將硫酸慶大霉素與大腸桿菌血清抗體和PEG6000結合后可增強抗菌效果，減少使用劑量，提高療效。 動物模型治療試驗表明：用高濃度靶向慶大霉素注射液每次肌注1.0mL/只，一次用藥后的有效率、治愈率分別為100％和90％；用中等濃度靶向慶大霉素注射液每次肌注1.0mL/只，一次用藥后的有效率、治愈率分別為100％和75％；用低濃度靶向慶大霉素注射液每

10、次肌注1mL/只，一次用藥后的有效率為100％，治愈率為65％。而硫酸慶大霉素對照組用硫酸慶大霉素注射液每次肌注1.0mL/只，后發(fā)病小白鼠治療無效或全部死亡；血清對照組也治療無效。靶向慶大霉素注射液對小白鼠大腸桿菌病療效顯著。 復合物治療仔豬黃痢臨床治療試驗表明：靶向慶大霉素注射液能迅速殺死仔豬體內(nèi)的致病菌，減輕臨床癥狀，提高仔豬成活率。與硫酸慶大霉素相比較，用高劑量靶向慶大霉素注射液每次肌注2.0mg/Kg，一次用藥后發(fā)病仔

11、豬的有效率、治愈率均為100％；用中劑量靶向慶大霉素注射液每次肌注0.2mg/Kg，一次用藥后發(fā)病仔豬的有效率為100％，治愈率為96％；用低劑量靶向慶大霉素注射液每次肌注0.02mg/Kg，兩次用藥后發(fā)病仔豬的有效率為96％，治愈率為92％；而用硫酸慶大霉素注射液每次肌注2.00mg/Kg，每天2次，連用3d后發(fā)病仔豬的有效率為84％，治愈率為76％；且用高劑量靶向慶大霉素注射液、中劑量靶向慶大霉素注射液、低劑量靶向慶大霉素注射液治療

12、的仔豬體內(nèi)致病菌減少速度均要比硫酸慶大霉素注射液快得多。抗血清與慶大霉素結合物注射液能有效殺滅致病性大腸桿菌，對仔豬黃痢病有很好的臨床療效。 復合物治療雞大腸桿菌病臨床治療試驗表明：抗血清與慶大霉素復合物各劑量組給藥1d，病雞病癥均明顯減輕，高劑量組第2d雞停止死亡，雞的食欲和精神基本恢復；中劑量組治療效果與高劑量組的治療效果基本一致；低劑量組第2d雞停止死亡，腹瀉癥狀基本消失，雞的食欲與精神狀態(tài)第3d也基本恢復。硫酸慶大霉素組

13、給藥第2d癥狀開始減輕，到第4d腹瀉癥狀基本消失，食欲和精神狀態(tài)到第5d恢復。從上表數(shù)據(jù)可以看出：抗血清與慶大霉素結合物注射液高、中、低三種劑量對雞大腸桿菌病療效顯著，有效率和治愈率分別為100％，100％，92％；100％，100％，90％。而硫酸慶大霉素組的有效率和治愈率分別為80％；70％。就癥狀變化情況看，抗血清與慶大霉素結合物各劑量組給藥后腹瀉癥狀改善速度和雞的精神狀態(tài)恢復速度較快，和硫酸慶大霉素組相比能更快地改善雞腹瀉癥狀和