抗體偶聯(lián)納米粒的制備與體外靶向性檢測.pdf

1、納米給藥系統(tǒng)由于具有增大藥物的吸收、控釋藥物釋放、提高藥物靶向性與穩(wěn)定性、減少給藥次數(shù)和劑量、降低毒副作用等顯著優(yōu)勢，而在癌癥治療的研究中備受關(guān)注。將特異性抗體或配體修飾在納米粒表面可使藥物選擇性地在靶組織或靶器官濃集，從而進一步增加靶細胞對藥物的攝取，降低對正常細胞的毒副作用。研究表明，在急性髓系白血病HL60細胞表面特異性表達了CD33抗原，因此，可將抗CD33抗體作為靶向基團偶聯(lián)于納米粒表面，制備主動靶向納米給藥系統(tǒng)。利用體循環(huán)與

2、細胞內(nèi)部環(huán)境pH值的差異，選用pH敏感性材料作為藥物載體，實現(xiàn)智能釋藥。
　　 本研究將疏水性小分子葉酸(FA)接枝到羧甲基殼聚糖(CMCS)的C2-NH2上，合成了兩親性高分子載體材料FA-CMCS。該載體材料能將疏水性藥物包封于內(nèi)自組裝形成納米粒，并能響應(yīng)環(huán)境pH值而引起藥物釋放。在納米粒表面偶聯(lián)CD33抗體后，能準(zhǔn)確靶向至HL60細胞。本課題的主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:
　　 (1)以CMCS為原料，在EDC和NHS

3、的聯(lián)合催化作用下將FA接枝到CMCS的C2-NH2上，合成了兩親性高分子載體材料FA-CMCS。對原料和產(chǎn)物進行紅外光譜和核磁共振圖譜表征，證實了酰胺鍵的形成。調(diào)整反應(yīng)物的質(zhì)量配比，分別得到具有五種不同偶聯(lián)率的FA-CMCS，采用紫外分光光度法測得FA偶聯(lián)率分別為5.2％、9.3％、13.6％、19.7％和16.9％;改變反應(yīng)物中CMCS的分子量后得到四種具有不同偶聯(lián)率的FA-CMCS，分別為14.8％、15.6％、17.2％和19.7

4、％。
　　 (2)采用芘熒光探針光譜法測得FA-CMCS的臨界膠束濃度為0.1047mg/mL。以其為載藥納米材料，與模型藥物(MTX)在水溶液環(huán)境下通過超聲法自組裝形成載藥納米顆粒，并把藥物包封于內(nèi)部，形成的納米粒粒徑大小分布均勻，分散性良好，結(jié)構(gòu)緊致，呈現(xiàn)出較規(guī)則的球形，粒徑大小為150 nm左右，符合靶向制劑的要求。改變FA-CMCS的分子量，所形成的納米粒粒徑、Zeta電勢和包封率隨分子量的增加逐漸增大，但載藥量卻呈現(xiàn)出

5、不規(guī)則的變化規(guī)律;改變反應(yīng)體系中的藥物濃度，隨著濃度的減小，所形成的納米粒平均粒徑和Zeta電勢基本不變，包封率逐漸增大，而載藥量卻逐漸降低。因此得到最佳載體CMCS分子量為250kDa，載體與藥物的最佳反應(yīng)濃度之比為15∶1。
　　 (3)以載藥納米粒為基材，將抗CD33抗體偶聯(lián)于載藥納米粒表面，制得主動靶向納米粒，測定了抗體與納米粒的偶聯(lián)率、納米粒對細胞的靶向性與靶點位置，以及納米粒在體外的釋藥行為，并考察了抗體濃度對偶聯(lián)率

6、的影響，環(huán)境pH值以及載藥量兩個因素分別對納米粒釋藥行為的影響。ELISA法所測定的樣品抗體偶聯(lián)率約為2.45∶1，且隨著反應(yīng)體系中抗體濃度的減小，抗體的偶聯(lián)率也相應(yīng)降低。流式結(jié)果顯示有多達92.9％的細胞表面存在抗體偶聯(lián)的納米粒，熒光顯微鏡也觀測到熒光均勻分布在細胞表面，說明納米粒對HL60細胞有良好的靶向性。對納米粒的釋放行為進行研究顯示在pH7.4的環(huán)境中，18h后納米粒的累計釋藥率不超過30％，而在pH5.6的環(huán)境中，18h后納