鹿源性大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)機制的研究.pdf

1、大腸桿菌是人醫(yī)和獸醫(yī)臨床感染中最常見的病原菌之一。其血清型復(fù)雜，無理想的疫苗來預(yù)防，多采用有效的抗生素進行治療。由于抗生素的廣泛、持續(xù)和不當(dāng)使用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥株不斷增多，耐藥機制不斷變遷，有時甚至找不到可治之藥。近年來，鹿大腸桿菌病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，給養(yǎng)鹿業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，開展鹿源致病性大腸桿菌耐藥性研究，具有重要的理論和實際意義。 本研究通過藥敏性實驗對從吉林、河南及其它一些省市地區(qū)臨床分離的鹿源致病性大腸桿

2、菌進行了耐藥性初步調(diào)查，選取了10株對β-內(nèi)酰胺類抗生素具有不同耐藥強度的菌株，進行了6種β-內(nèi)酰胺類抗生素最小抑菌濃度(MIC)的測定，確定致病菌的耐藥譜；對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)基因blaAmpC、pbpA、ompFA、ompCA進行了PCR檢測、克隆與測序，分析它們與耐藥強度的相關(guān)性；同時應(yīng)用實時熒光定量PCR(real-timePCR)與Western-blot方法對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)編碼基因—blaAmpC的

3、mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平進行了定量測定。 結(jié)果顯示，10株菌的MIC在2～256μg/mL之間，它們對臨床應(yīng)用較多的氨芐西林、阿莫西林的耐藥性很高，除6號、8號株對氨芐西林的MIC分別為16μg/mL、18μg/mL，其它菌株MIC均≥128μg/mL。陽性克隆質(zhì)粒的測序結(jié)果顯示，與GeneBank中所參考序列相比：青霉素結(jié)合蛋白(PBP)編碼基因pbpA有5個堿基發(fā)生了突變，1個氨基酸發(fā)生了改變；外膜蛋白(OMP)基因o

4、mpFA有7個堿基發(fā)生了突變，相應(yīng)7個氨基酸發(fā)生了改變；ompCA有11個堿基發(fā)生了突變，7個氨基酸發(fā)生了改變；blaAmpC基因有2個堿基發(fā)生了突變，氨基酸未發(fā)生改變。ELISA結(jié)果顯示成功獲得了blaAmpC蛋白抗體且抗體滴度達10,000倍。經(jīng)real-timePCR及Western-blot檢測顯示耐藥水平高的菌株其mRNA及ESBLs表達水平也高。 結(jié)果表明，本實驗所分離的鹿源致病性大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥十分

5、嚴(yán)重，因此在治療前對病原進行耐藥性檢測十分必要；PBP發(fā)生改變及OMP通透性改變常引起低水平耐藥，而本實驗分離的大腸桿菌耐藥水平很高，所以受試大腸桿菌耐藥現(xiàn)象可能與PBP2、OmpF和OmpC改變有一定關(guān)系，但不是主要因素；受試大腸桿菌blaAmpC基因的mRNA和蛋白表達水平與其耐藥水平具有一定的相關(guān)性，blaAmpC的mRNA水平與其蛋白表達水平基本一致，因此，blaAmpC基因編碼的ESBLs可能是導(dǎo)致本實驗所分離大腸桿菌耐藥的主