腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥機制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬通過對四川省某三甲醫(yī)院臨床分離的60株多重耐藥的腸桿菌科細菌耐藥譜進行分析,篩選出對碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細菌10株進行碳青霉烯酶表型、耐藥基因、外膜蛋白的檢測以及檢測整合子和質(zhì)粒結(jié)合試驗的研究，旨在闡明腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制以及細菌耐藥性的水平傳播能力，對指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，減少耐藥菌株的產(chǎn)生、控制和預(yù)防耐藥菌株的流行提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集四川省

2、某三甲醫(yī)院2010年1月-2011年5月臨床分離的多重耐藥的腸桿菌科細菌。2.用瓊脂稀釋法檢測多重耐藥的腸桿菌科細菌對13種抗生素的最低抑菌濃度(MIC),分析其耐藥譜,篩選出對碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細菌。3.改良Hodge試驗篩查對碳青霉烯類抗生素耐藥菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的情況。4.EDTA雙紙片協(xié)同試驗篩查對碳青霉烯類抗生素耐藥菌株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶情況。5.利用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,

3、 PCR)技術(shù)檢測耐碳青霉烯類抗生素菌株耐藥基因,其測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對。6.膜孔蛋白逆轉(zhuǎn)錄Real-time PCR分析耐藥株膜孔蛋白的表達情況。7.利用PCR技術(shù)擴增耐碳青霉烯類抗生素菌株整合子并分析其基因序列。8.利用質(zhì)粒結(jié)合試驗研究耐碳青霉烯類抗生素菌株耐藥性的水平傳播能力。
　　結(jié)果：
　　1.收集60株四川某三甲醫(yī)院臨床分離的多重耐藥的腸桿菌科細菌。2.本研究利用瓊脂稀釋法藥敏試驗對60株臨床分

4、離的多重耐藥的腸桿菌科細菌的耐藥譜進行分析,有10株細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥,其中包括:5株肺炎克雷伯菌,4株陰溝腸桿菌和1株植生拉烏爾菌。多重耐藥菌株中對碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的分離率為16.67％。這10株細菌對厄他培南、美羅培南、亞胺培南的耐藥率分別為100％、70％、10％。對頭孢曲松鈉、頭孢他啶、和頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率均為100％,頭孢西丁鈉和頭孢吡肟的耐藥率分別為90％、80％。對阿米卡星和多粘菌素B的敏感率最高,分

5、別為90％和80％。3.改良Hodge試驗在10株耐碳青霉烯類抗生素細菌中檢測有7株陽性,菌株分別為K13、K25、K30、E3、E8、E13和R1。4.EDTA雙紙片協(xié)同試驗檢測在10株耐碳青霉烯類抗生素細菌中有4株陽性,菌株分別為K13、K17、E3和R1。5.在10株菌中共檢出6種耐藥基因,碳青霉烯酶相關(guān)基因IMP、KPC陽性株數(shù)分別為4株(40％)、1株(10％);編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因CTX、TEM、SHV的

6、陽性株數(shù)分別為10株(100％)、5株(50％)、8株(80％);AmpC酶相關(guān)基因DHA2株(20％)陽性。經(jīng)GenBank比對碳青霉烯酶基因4株IMP酶為IMP-4型,1株KPC酶為KPC-2型;超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因檢出較多的是 CTX-M3、TEM-1、SHV-12和SHV-28;AmpC酶相關(guān)基因為DHA-1。6.利用逆轉(zhuǎn)錄Real-time PCR對膜孔蛋白的分析發(fā)現(xiàn)有2株肺炎克雷伯桿菌的膜孔蛋白ompK36的表達量下降,有

7、3株陰溝腸桿菌的膜孔蛋白 ompF的表達量下降。7.整合子擴增有7株陽性,且擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后分析其序列證實均為I類整合子,較多的基因盒組合為dfrA12-orfF-aadA2。較常見的耐藥基因為氨基糖苷類抗生素耐藥基因(aadA2和aadA16),其次為甲氧芐啶耐藥基因(dfrA12、dfr16和dfrA27)。8.在這10株研究的細菌中對5株攜帶碳青霉烯酶基因的細菌進行結(jié)合試驗,有4株產(chǎn)IMP-4的腸桿菌結(jié)合成功。結(jié)合子的藥敏結(jié)果與其

8、供體菌的藥敏結(jié)果相似;EDTA協(xié)同試驗篩查4株結(jié)合子均產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶;4株結(jié)合子的質(zhì)粒大小相近。
　　結(jié)論：
　　1.本研究在60株臨床分離的多重耐藥的腸桿菌科細菌中篩選出10株對碳青霉烯類抗生素耐藥。這10株細菌對頭孢菌素類抗生素耐藥較高,而對阿米卡星和多粘菌素B保持較高的活性。
　　2.對10株耐碳青霉烯類抗生素細菌耐藥機制的研究發(fā)現(xiàn):產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶合并產(chǎn)ESBLs和膜孔蛋白表達下降合并產(chǎn)ESBLs是細菌耐