碳青霉烯類藥物非敏感腸桿菌科細菌基因型研究及同源性分析.pdf

1、目的:
　　近年來由于大量使用碳青霉烯類抗菌藥物，使該類藥物對產(chǎn)ESBLS和頭孢菌素酶的腸桿菌科細菌的抗菌活性下降，而腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性則明顯增強。
　　本研究擬分析碳青霉烯類藥物非敏感腸桿菌科細菌的表型和基因型，探討該類細菌的流行情況和耐藥機制，為臨床合理使用抗菌藥物和減少院內(nèi)感染提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.收集2010年1月至2013年10月，來自臨床標本的碳青霉烯類藥物非敏感腸桿菌

2、科細菌125株，紙片擴散法檢測細菌的敏感性，改良Hodge試驗(MHT)檢測碳青霉烯酶的表型，紙片擴散表型確證試驗檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLS)。
　　2.PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)DNA測序后，通過BLAST比對等方法確定收集的125株菌株中攜帶的碳青霉烯酶、質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因型。
　　3.脈沖場凝膠電泳技術(shù)對收集到的125株菌株進行同源性分析。
　　4.隨機挑選30株已經(jīng)檢測出含bl

3、aKPC-2耐藥基因的菌株，用堿裂解法提取質(zhì)粒，PCR擴增編碼KPC-2的基因，構(gòu)建表達載體pEASY-T1-KPC-2，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR后測序，以確認構(gòu)建和轉(zhuǎn)化是否成功，并對測序成功的轉(zhuǎn)化菌株做藥敏試驗。
　　結(jié)果:
　　1.藥敏試驗結(jié)果125株碳青霉烯類藥物非敏感腸桿菌科細菌對頭孢噻肟和阿莫西林/克拉維酸耐藥率最高，均為93.6％;對環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、頭孢他啶、頭孢西丁、氨曲南、亞胺培南和厄

4、他培南的耐藥率在64.0％～89.6％之間;對阿米卡星、妥布霉素、呋喃妥因和頭孢吡肟耐藥率相對較低，為14.4％～38.4％;對替甲環(huán)素和米諾環(huán)素敏感率高，分別為88.0％和84.0％，檢出11株對替甲環(huán)素中介株和4株耐藥株，其中對替甲環(huán)素耐藥細菌分別為2株粘質(zhì)沙雷菌和2株產(chǎn)氣腸桿菌。
　　2.改良Hodge試驗及ESBLS表型試驗結(jié)果125株碳青霉烯類藥物非敏感腸桿菌科細菌中，共檢出產(chǎn)碳青霉烯酶細菌(Hodge試驗陽性)為89株

5、，占71.2％，其中大腸埃希菌為主要檢出菌有58株，占65.2％(58/89)，其次是陰溝腸桿菌15株，占16.9％(15/89)，粘質(zhì)沙雷菌7株，占7.9％(7/89)，產(chǎn)氣腸桿菌6株，占6.7％(6/89)。產(chǎn)ESBLS的細菌為42株，占33.6％。同時產(chǎn)這兩種酶的細菌為23株，占18.4％。
　　3.耐藥酶基因檢測及序列測定結(jié)果125株碳青霉烯類藥物非敏感腸桿菌科細菌中，分別有42(33.6％)、5(4.0％)和1(0.8％

6、)株細菌檢出blaKPC-2、blaIMP-26和blaVIM-2等碳青霉烯酶基因;分別有18(14.4％)、9(7.2％)和2(1.6％)株細菌檢出blaCTX-M-15、 blaSHV-12和blaCTX-M-3等ESBLS基因;分別有19(15.2％)和13(10.4％)株細菌檢出b laACT-1和blaCMV-2等AmpC酶基因。其中71株大腸埃希菌中檢出39(54.9％)株菌攜帶blaKPC-2基因，分別有17(23.9％)

7、和3(4.2％)株攜帶blaCTX-M-15和blaSHV-12基因，分別有12(16.9％)和2(2.8％)株攜帶blaCMY-2和blaACT-1基因。20株陰溝腸桿菌中分別檢出5(25.0％)和1(5.0％)株菌攜帶blaIMP-26和blaVIM-2基因，分別有5(25.0％)和2(10.0％)株菌攜帶blaSHV-12和blaCTX-M-3基因，有17(85.0％)株攜帶blaACT-1基因。17株產(chǎn)氣腸桿菌檢出blaKPC-

8、2和blaSHV-12基因陽性各1株;12株黏質(zhì)沙雷菌中檢出1株blaKPC-2基因陽性。1株檸檬酸桿菌檢出 blaKPC-2和blaCMY-2基因陽性，另1株檸檬酸桿菌檢出blaCTX-M-15基因陽性。未檢出GES、IMI、GIM、SPM、SIM、NDM-1和OXA等其他基因型。2株摩根摩根菌和1株奇異變形桿菌中未檢出碳青霉烯酶和ESBLS等基因。
　　4.脈沖場凝膠電泳(PFGE)將125株菌株分為8個譜型，19個亞型。其中

9、以A型為主，共有57株，占45.6％(57/125)，其次為D型有18株，占14.4％(18/125)，再者為B型有15株，占12.0％(15/125)。
　　5.轉(zhuǎn)化試驗及藥敏結(jié)果 PCR結(jié)果顯示，隨機挑選的陽性菌落均含重組質(zhì)粒，測序驗證30株轉(zhuǎn)化菌株pEASY-T1-KPC-2載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化全部成功。隨機選取10株pEASY-T1-KPC-2載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化成功的菌株經(jīng)過紙片擴散法藥敏試驗驗證，8株轉(zhuǎn)化菌株出現(xiàn)對頭孢菌素類、碳青

10、霉烯類、單環(huán)酰胺類以及β-內(nèi)酰胺類聯(lián)合酶抑制劑類藥物耐藥，另外2株對這些藥物敏感。3株子代菌株與原代轉(zhuǎn)化菌株的藥敏結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.碳青霉烯類藥物非敏感腸桿菌科細菌對所檢測的β-內(nèi)酰胺類藥物呈現(xiàn)多重耐藥，米諾環(huán)素和替甲環(huán)素敏感率高，臨床可考慮使用這兩種藥物進行臨床感染治療。
　　2.碳青霉烯類藥物非敏感腸桿菌科細菌碳青霉烯酶基因以blaKPC-2為主，主要存在于大腸埃希菌。其次為blaIMP-26和bla