動(dòng)物源性大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、氨基糖苷類抗生素是一類高效廣譜的抗生素，由于在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，導(dǎo)致該類抗生素在治療中的作用受到了限制，但它的化學(xué)結(jié)構(gòu)，活性，藥動(dòng)力學(xué)等方面的研究已成熟，半合成的氨基糖苷類抗生素難以在結(jié)構(gòu)上有所改變，所以了解細(xì)菌的耐藥機(jī)制已是刻不容緩。 本研究主要經(jīng)最低抑菌(MIC)測(cè)定從臨床分離的15株大腸桿菌中篩選2株高度耐藥株，4株中度耐藥株，1株低程度耐藥株，從不同的角度對(duì)這7株耐藥菌耐藥機(jī)制進(jìn)行研究

2、，以期對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥性的監(jiān)測(cè)、控制作出有益的探索。 首先選取鈍化氨基糖苷類藥物三種酶的五種基因acc(6')-Ib，acc(3)-IV，aadA，aphA，aph(2")對(duì)7株耐藥菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這幾種基因所編碼的鈍化酶在大腸桿菌中較為常見，但僅有aphA基因擴(kuò)增成功，所以初步斷定引起這幾株菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥的主要機(jī)制是aphA編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶的作用。 然后通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)這7株耐藥菌a

3、phA基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)，方法主要是設(shè)計(jì)參比引物構(gòu)建表達(dá)載體，提取大腸桿菌的RNA，并反轉(zhuǎn)錄，利用所設(shè)計(jì)的檢測(cè)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR。結(jié)果得出不同耐藥強(qiáng)度的大腸桿菌aphA基因mRNA表達(dá)水平存在著差異，二者呈正相關(guān)，并且通過耐藥性和表達(dá)水平的差異，推斷出這7株菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥的主要機(jī)制是aphA基因產(chǎn)生的磷酸轉(zhuǎn)移酶的鈍化作用。 同時(shí)也通過westernblotting的方法對(duì)aphA基因蛋白表達(dá)

4、進(jìn)行了定性檢測(cè)，其方法是將aphA基因克隆表達(dá)，將表達(dá)后的蛋白作為抗體免疫動(dòng)物，制備抗體血清，通過westernblotting的方法對(duì)不同耐藥強(qiáng)度的大腸桿菌aphA基因蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，得出耐藥強(qiáng)度同大腸桿菌aphA基因蛋白表達(dá)水平成正相關(guān)，結(jié)論與上述方法相一致。 通過上述結(jié)果的進(jìn)一步分析4株中度耐藥菌的耐藥強(qiáng)度相當(dāng)，所檢測(cè)到表達(dá)水平也相當(dāng)，所以引起它們的主要耐藥機(jī)制就是aphA基因編碼鈍化酶的作用。高度耐藥的兩株菌在檢測(cè)

5、中aphA基因的表達(dá)有差異，但它們的耐藥強(qiáng)度相當(dāng)，所以還應(yīng)有其他的耐藥機(jī)制存在。為了能更深入了解兩株高度耐藥菌(7、5號(hào))的差異所在，本實(shí)驗(yàn)選取了編碼16SrRNA基因rrsA和核糖體蛋白基因rpsL，將其克隆到pGEM-TEasy載體上，觀察這兩個(gè)基因編碼的核糖體突變情況，其中7號(hào)菌的apA基因的表達(dá)水平較低，其rrsA基因發(fā)生了突變，5號(hào)菌未發(fā)生突變，而rpsL基因均未見突變。由此可見引起7號(hào)菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥是由rrsA，ap